DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Summary

Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

Abstract

Disease Entwicklung und Progression sind durch häufige genetische und epigenetische Aberrationen einschließlich chromosomalen Umlagerungen Kopienzahl Gewinne und Verluste und DNA-Methylierung gekennzeichnet. Advances in High-Throughput-, Genom-weiten Profiling-Technologien, wie zB Microarrays, haben deutlich unsere Fähigkeit zur Identifizierung und Erkennung dieser spezifischen Veränderungen verbessert. Doch die Technik zu verbessern fortsetzt, bleibt ein limitierender Faktor Probe Qualität und Verfügbarkeit. Darüber hinaus Follow-up der klinischen Informations-und Krankheitsverlauf sind oft Jahre nach der ersten Probenentnahme gesammelt. Die Proben werden typischerweise Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), in Krankenhaus-Archiven für Jahre bis Jahrzehnte gespeichert. DNA effizient und effektiv von in Paraffin eingebetteten Proben gewonnen werden, wenn die entsprechende Methode der Extraktion angewendet wird. Hochwertige DNA aus ordnungsgemäß konserviert und gelagert Proben extrahiert werden können quantitative Tests für Vergleiche von gesunden und kranken Geweben und Generierung von genetischen und epigenetischen Signaturen ¹ zu unterstützen. So extrahieren DNA aus Paraffin eingebettete Proben, Gewebe-Kerne oder mikrodissezierten Gewebe sind Xylol Behandlung, die das Paraffin aus dem Gewebe löst unterzogen und anschließend rehydriert mit einer Reihe von Ethanol wäscht. Proteine ​​und schädliche Enzyme, wie Nukleasen werden anschließend durch Proteinase K. Die Zugabe von Lysepuffer, die Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, erleichtert die Verdauung ² verdaut. Nukleinsäuren sind aus dem Gewebe Lysat unter Verwendung von Puffer-gesättigtem Phenol und Hochgeschwindigkeitszentrifugation die eine biphasische Lösung generiert gereinigt. DNA und RNA bleiben in der oberen wässrigen Phase, während Proteine, Lipide und Polysaccharide in der inter-und organisch-Phasen jeweils beschlagnahmt. Retention der wässrigen Phase und wiederholte Phenolextraktionen erzeugt eine saubere Probe. Nach Phenolextraktionen ist RNase A aufgenommen, um kontaminierende RNA zu eliminieren. Zusätzliche Phenolextraktionen nach Inkubation mit RNase A verwendet werden, um alle verbleibenden Enzym zu entfernen. Der Zusatz von Natriumacetat und Isopropanol fällt DNA und Hochgeschwindigkeitszentrifugation ist Pellet der DNA eingesetzt und erleichtern Isopropanol entfernen. Überschüssige Salze über aus Fällung mit nachfolgender enzymatischer Assays stören, kann aber aus der DNA durch Waschen mit 70% Ethanol, gefolgt von Zentrifugation, um re-Pellet der DNA ³ entfernt werden. DNA wird in destilliertem Wasser oder der Puffer der Wahl erneut suspendiert, quantifiziert und bei -20 ° C. Gereinigte DNA kann anschließend in nachgelagerten Anwendungen, die auch verwendet werden, sind aber nicht beschränkt auf, PCR, array komparative genomische Hybridisierung ⁴ (Array-CGH), methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) und Sequenzierung, so dass für eine integrative Analyse der Gewebe / Tumorproben.

Protocol

<p class="jove_title"> 1 ist. Hinweise zum Verfahren</p><ul><li> Xylol und Phenol sind giftige Chemikalien und sollte in einem Abzug durchzuführen behandelt werden. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch.</li><li> Xylol löst bestimmte Kunststoffe, Polypropylen-Röhrchen zu verwenden, wie sie diese Verbindungen zu dulden.</li><li> Special Tipps können gekauft, die über einen internen Holzkohle Stopfen werden. Dies verhindert das Xylol aus aufzulösen, Gummiteile in der Pipette. Alternativ können Filter-Spitzen verwendet werden.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Paraffin Entfernung</p><ol><li> In einem Abzug durchzuführen, fügen Sie 800 ul Xylol (VWR, CABDH6216-4), um die markierten Röhrchen mit Ihrer Probe und auf eine Wippe mit leichtem Schütteln für 5 bis 15 Minuten, um das Paraffin zu lösen.</li><li> Pellet der Probe durch Spinnen bei Höchstgeschwindigkeit (14.000 rpm oder 16 000 xg) in einer Mikrozentrifuge für 3 Minuten. Vorsichtig zurückziehen Xylol Überstand und verfügen in einem Polypropylen-Röhrchen verwerfen in das Xylol Abfall. Achten Sie darauf, das Pellet stören.</li><li> Wiederholen Xylol waschen Sie die Schritte 1 und 2until Paraffin vollständig gelöst ist. Dies erfordert in der Regel zwei vor drei Wäschen, je nach Größe der Gewebeprobe. Ein voll gelösten Probe erscheint weich, und manchmal verlieren ihre strukturelle Integrität. Die Integrität der Probe vorsichtig mit einer Pipettenspitze beurteilt werden.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Ethanol Rehydratation</p><ol><li> Add 800 ul 100% Ethanol (v / v) Molekularbiologie Ethanol, vortexen, dann für 3 Minuten Spin bei 14.000 rpm in Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand Ethanol, darauf achten, daß das Pellet stören.</li><li> Add 800 ul 70% igem Ethanol (100% (v / v) Ethanol in destilliertem Wasser verdünnt (dH₂ O)), Vortex-und Spin 3 Minuten lang bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand Ethanol.</li><li> Add 800 ul 50% igem Ethanol (100% (v / v) Ethanol in destilliertem Wasser verdünnt (dH₂ O)), Vortex-und Spin für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Vorsichtig so viel Ethanol wie möglich zu entfernen durch Pipettieren. Seien Sie äußerst vorsichtig, das Pellet an dieser Stelle vollständig rehydriert Gewebe wird nicht Pellet sowie dehydrierten Gewebe.</li><li> Nach dem Entfernen des Ethanols Überstand, an der Luft trocknen das Pellet für 5 Minuten, wobei darauf geachtet, nicht über trocken.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Tissue Verdauung</p><ol><li> Add 200-500 ul Lysepuffer (Formel unten). Re-suspend das Pellet mit einer Pipettenspitze oder ein Wirbel. Zusätzlichen Aufwand an dieser Stelle vollständig resuspendieren das Gewebe wird in eine vollständige Verdauung der Probe und eine bessere Ausbeute der DNA führen.</li><li> Inkubieren Proben bei 56 ° C im Wasserbad oder Heizblock.</li><li> Für Gewebekerne, spike 20 ul Proteinase K (20 mg / ml Stammlösung, Invitrogen, AM2548) morgens und abends.</li><li> Über die Verdauung Schritte für 2 bis 5 Tagen wiederholen, bis das Gewebe vollständig gelöst ist.</li></ol><p class="jove_step"> Lysispuffer</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li><li> 100 mM EDTA pH 8,0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> 0,5% SDS</li><li> 200 pg / ml Proteinase K (kurz vor Gebrauch hinzufügen)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA bereinigen</p><ol><li> Add dem gleichen Volumen Puffer gesättigtem Phenol (Fisher, BP1750I-400) und mischen durch Umdrehen. Spin für mindestens 5 Minuten bei 14.000 rpm in Mikrozentrifuge.</li><li> Transfer der wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen. Beachten Sie die Interphase: gibt es eine Menge von weißem Stoff?</li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 auf der wässrigen Fraktion, bis die Interphase klar ist (typischerweise 3 oder mehrmals). Führen Rückextraktionen *, wenn der Interphase Fuzzy bis zur endgültigen Ertrag zu erhöhen.</li><li> Nach der Interphase ist klar, ein gleiches Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400), um die extrahierten wässrigen Fraktion der Probe. Mix für 5 Minuten und dann Spin für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Thisreduces Restphenol und weiter schärft die Interphase, die Erleichterung Extraktion der wässrigen Schicht</li><li> Entfernen der wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen und treatwith RNase A bei 100 ug / ml für 1 Stunde bei 37 ° C.</li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 4, um alle verbleibenden RNase A zu entfernen und die wäßrige Fraktion. Sie sollten nur noch 1 oder 2 Puffer gesättigtem Phenol Schritte, da es viel weniger Eiweiß als in der ersten Lysat zu entfernen sein sollte.</li></ol><p class="jove_content"> * Um wieder durchführen Extraktionen add 50-100 &mgr; l dH₂ 0, die Probenröhrchen mit der Interphase und organische Anteil. Das Röhrchen zu mischen, und drehen Sie die Probe bei 14.000 rpm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten. Sammeln Sie die wässrige Phase und fügen Sie sie der zuvor erworbenen wässrige Extraktion. Weiter Rückextraktionen bis die Interphase ist klar.</p><p class="jove_title"> 6. DNA-Fällung</p><ol><li> Schätzung des Volumens der über Sie erhobenen wässrige Schicht.</li><li> Add 1 / 10 des Volumens von 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 1 Volumen 100% Isopropanol (v / v) Molekularbiologie (oder 2,5 Volumen 100% Ethanol).</li><li> Gut mischen und auf Eis gelegt oder in einem -20 ° C Gefrierschrank für 30 Minuten oder über Nacht.</li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit (14.000 rpm) bei 4 ° C in Mikrozentrifuge für 10 Minuten</li><li> Überstand verwerfen.</li><li> Waschen des Pellets mit 70% eiskaltem Ethanol, um unerwünschte Salze zu entfernen.</li><li> Re-suspend das Pellet in dem Puffer der Wahl (in der Regel dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. DNA-Quantifizierung</p><ol><li> Quantifizierung der Konzentration von DNA. Die A260: A280-Verhältnis sollte ~ 1,8. Für kleine Mengen an DNA, ist die Messung mit einem Spektralphotometer NanoDrop bevorzugt.</li><li> Nach Quantifizierung, Gelelektrophorese durchgeführt werden, um die Qualität Ihrer Proben-DNA-Test und bestimmen, ob kontaminierenden RNA wurde vollständig abgebaut werden.</li><li> Hochwertige extrahierten DNA eignet sich nun für nachgelagerte Anwendungen, oder kann bei -20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Wenn RNA ist noch heute in Ihrer Probe, wiederholen Sie die DNA Clean-up und Niederschläge Schritte, und wieder zu quantifizieren und zu qualifizieren, die Qualität Ihrer Proben.</li></ol>

Discussion

Biopsiert oder chirurgisch exzidiert Gewebe für histologische Analyse und Diagnose sind oft Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) für die langfristige Lagerung. Mit dem wachsenden Interesse für das Verständnis der genetischen Grundlagen von Krankheiten, stellt die Fähigkeit, DNA aus diesen Proben extrahiert eine unschätzbare Quelle für diagnostische Material, das für die genomische Analyse und translationale Studien verwendet werden können. Historisch FFPE-Proben wurden als nicht gangbar Quelle für die molekulare Analyse von Nukleinsäuren kann stark von Protein-Nukleinsäure-und Protein-Protein-Quervernetzung ⁶ geändert werden. Ermöglicht jedoch die Entdeckung, dass Proteaseverdau fragmentierten Nukleinsäuren, die für Downstream-Analysen, einschließlich PCR, Array-CGH, ​​Sequenzierung und Methylierung Profilierung sind frei, die Nutzung dieser wertvollen Proben für genetische Analyse ^6..

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebetteten Gewebe ist ein robustes Verfahren, das auf unterschiedliche Löslichkeit der DNA zu reinigen beruht. Die extrahierte DNA Qualität und Quantität und der Erfolg der anschließenden DNA-Amplifikation ist abhängig von einer Reihe von Parametern vor, während und nach der Extraktion. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Art und Menge des Gewebes, auf die Art der Fixativ für Gewebe Konservierung verwendet, die Dauer der Fixierung, Alter der Paraffinblock-und Lagerbedingungen sowie die Länge der gewünschten DNA-Segment werden verstärkt ^1,7. Entfernung von Paraffin aus dem Gewebe ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Extraktion als ungelöst Paraffin führt zu einer schlechten Qualität der Proben und der Hemmung der PCR-Amplifikation.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–