استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني
Summary
هذا الفيديو يوضح البروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الفورمالين الثابتة المادية جزءا لا يتجزأ من البرافين. هذا الإجراء عدة أيام في المقاطع التي هي نسيج deparaffinized مع الزيلين ، ممهى مع الإيثانول ومعاملته ك بروتين لتنقية وعزل الحمض النووي لاحقة تحليل الجينات الوراثية المحددة أو واسعة.
Abstract
تتميز تطور المرض والتقدم المتكررة من قبل الانحرافات الجينية ، وبما في ذلك إعادة ترتيب الكروموسومات اللاجينية ، والمكاسب والخسائر في عدد النسخ والحامض النووي. وقد تحسنت التقدم في الإنتاجية العالية ، والتقنيات التنميط الجينوم واسعة ، مثل ميكروأرس ، بشكل كبير من قدرتنا على تحديد والكشف عن هذه التعديلات محددة. ولكن التكنولوجيا لا تزال في التحسن ، لا يزال عاملا مقيدا نوعية العينة ومدى توافرها. غالبا ما يتم جمع المعلومات السريرية وعلاوة على ذلك ، ومتابعة ونتائج المرض بعد سنوات من جمع العينات الأولية. العينات ، يتم عادة تخزين الفورمالين الثابتة وجزءا لا يتجزأ من البرافين (FFPE) ، في محفوظات المستشفى لسنوات وعقود. الحمض النووي يمكن بكفاءة وفعالية تعافى من العينات ، جزءا لا يتجزأ من البارافين إذا تم تطبيق الأسلوب المناسب لاستخراج. عالية الجودة يمكن أن الحمض النووي المستخرج من عينات المحفوظة بشكل صحيح وتخزينها دعم المقايسات الكمية لمقارنات بين الأنسجة الطبيعية والمريضة وجيل من التوقيعات وراثية وجينية 1. لاستخراج الحمض النووي من العينات ، جزءا لا يتجزأ من البرافين ، النوى الأنسجة أو الأنسجة microdissected يتعرضون لمعاملة الزيلين ، والذي يذوب البارافين من الأنسجة ، وممهى ثم باستخدام سلسلة من يغسل الايثانول. يتم هضمها في وقت لاحق من البروتينات والانزيمات الضارة مثل nucleases بواسطة بروتين كاف إضافة العازلة تحلل ، والذي يحتوي على عوامل تغيير طبيعة مثل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، ويسهل الهضم 2. يتم تنقيتها من الأحماض النووية lysate باستخدام الأنسجة العازلة المشبعة الطرد المركزي بسرعة عالية والفينول الذي يولد حل ثنائي الطور. DNA و RNA البقاء في المرحلة مائي العلوي ، في حين تحتجز البروتينات والدهون والسكريات على التوالي في جملة والعضوية المراحل الإضافية. الإبقاء على المرحلة المائية وقلع الفينول المتكررة يولد عينة نظيفة. بعد قلع الفينول ، يضاف ريبونوكلياز A للقضاء على تلويث الحمض النووي الريبي. قلع الفينول الإضافية التالية مع ريبونوكلياز الحضانة وتستخدم لإزالة أي انزيم المتبقية. وتستخدم إضافة خلات الصوديوم والحمض النووي الأيزوبروبانول رواسب ، وارتفاع سرعة الطرد المركزي لتكوير الحمض النووي وتسهيل إزالة الأيزوبروبانول. يمكن ترحيلها الأملاح الزائدة من الأمطار تتداخل مع المقايسات الأنزيمية لاحقة ، ولكن يمكن إزالتها من الحمض النووي عن طريق الغسيل مع الايثانول 70 ٪ ، تليها الطرد المركزي لتكوير إعادة الحمض النووي 3. الحمض النووي هو إعادة معلقة في الماء المقطر أو عازلة للاختيار ، كميا وتخزينها على -20 درجة مئوية. ويمكن بعد ذلك تنقية الحمض النووي يمكن استخدامها في تطبيقات المصب التي تشمل ، ولكنها ليست على سبيل الحصر ، PCR ، مجموعة التهجين الجينومي المقارن 4 (CGH الصفيف) ، مناعي ميثليته الحمض النووي (MeDIP) والتتابع ، والسماح لإجراء تحليل لعينات الأنسجة تكاملية / الورم.
Protocol
Discussion
أنسجة الخزعة أو استئصاله جراحيا لتحليل histopathologic والتشخيص وغالبا ما تكون ثابتة وجزءا لا يتجزأ من الفورمالين البارافين (FFPE) للتخزين على المدى الطويل. مع تزايد الاهتمام في فهم الأساس الجيني للمرض ، والقدرة على استخراج الحمض النووي من هذه العينات يمثل مصدرا قيما للمواد التشخيص التي يمكن استخدامها لتحليل ودراسات الجينوم متعدية. لم تكن تعتبر تاريخيا عينات FFPE مصدر قابلة للتحليل الجزيئي قد تكون الأحماض النووية بشدة تعديل الحمض النووي والبروتينات والبروتين البروتين عبر ربط 6. ومع ذلك ، اكتشاف أن الهضم البروتيني النشرات الأحماض النووية المجزأة التي هي مناسبة لتحليلات المصب بما في ذلك الاسترداد ، CGH الصفيف ، وتسلسل والتنميط مثيلة ، وتمكن من استخدام هذه العينات للتحليل الجيني قيمة 6.
استخراج الحمض النووي من البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة هو إجراء القوية التي تعتمد على ذوبان في الفرق لتنقية الحمض النووي. الحمض النووي المستخرج نوعية وكمية ونجاح تضخيم الحمض النووي لاحقة تعتمد على عدد من المعلمات قبل وأثناء وبعد الاستخراج. وتشمل هذه ، ولكنها لا تقتصر على : نوع وكمية من النسيج ، ونوع من استخدام مثبت للحفاظ على النسيج ، ومدة التثبيت ، وعمر كتلة البارافين وظروف التخزين ، فضلا عن طول الجزء المراد الحمض النووي تضخيم 1،7. إزالة البارافين من النسيج هي الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لاستخراج مثل هذا النجاح غير منحل البارافين يؤدي إلى جودة عينة الفقراء وتثبيط تضخيم PCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مختبر لام للتقييم ونقد من هذا الفيديو والمادة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
