הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Summary

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

Abstract

התפתחות מחלות התקדמות מאופיינים סטיות גנטיות epigenetic תכופים כולל rearrangements כרומוזומליות, מספר רווחי העתק הפסדים מתילציה בדנ"א. ההתקדמות תפוקה גבוהה, הגנום כולו טכנולוגיות אפיון, כגון microarrays, שיפרו באופן משמעותי את היכולת שלנו לזהות לזהות אלו שינויים ספציפיים. אולם ככל שהטכנולוגיה ממשיכה להשתפר, גורם מגביל נשאר איכות המדגם זמינות. מידע קליני יתר על כן, מעקב והתוצאה מחלה נאספים לעתים קרובות שנים לאחר איסוף הדגימה הראשונית. דוגמאות, בדרך כלל, פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE), נשמרים בארכיון בית החולים במשך שנים עשורים. ה-DNA ניתן לשחזר ביעילות פרפין מ-מוטבע דגימות אם בשיטה המתאימה ממוצא מוחל. ה-DNA באיכות גבוהה המופק דגימות נשמר כראוי מאוחסנים יכול לתמוך מבחני כמותי להשוואות של רקמות בריאים וחולים, דור של חתימות גנטיות epigenetic ^1. כדי לחלץ דנ"א פרפין, מוטבע דגימות, גרעינים רקמה או רקמות microdissected כפופים טיפול קסילן, אשר ממיס את פרפין מן הרקמה, ואת rehydrated מכן באמצעות סדרה של שוטף אתנול. חלבונים ואנזימים מזיקים כגון nucleases מתעכלים לאחר מכן על ידי proteinase ק תוספת של חיץ תמוגה, אשר מכיל חומרים denaturing כגון נתרן גופרתי dodecyl (SDS), מקלה על העיכול ^2. חומצות גרעין הן מטוהרים מן lysate את הרקמה באמצעות חיץ רווי צנטריפוגה מהירות פנול גבוהה אשר מייצר פתרון biphasic. DNA ו-RNA נשארים בשלב מימית העליון, בעוד חלבונים, שומנים סוכרים הם מוחרם בין ואורגניים שלבי בהתאמה. שמירה של השלב מימיות עקירות פנול חזר יוצר מדגם נקי. בעקבות עקירות פנול, RNase מתווסף לחסל רנ"א מזהם. פנול עקירות נוספות הבאים הדגירה עם RNase משמשים כדי להסיר כל אנזים הנותרים. תוספת של נתרן אצטט ו-DNA isopropanol משקעים, ו צנטריפוגה במהירות גבוהה משמש גלולה את ה-DNA ולאפשר הסרת isopropanol. עודף מלחים שמקורם משקעים יכול להפריע מבחני האנזימטית שלאחר מכן, אבל ניתן להסיר את ה-DNA על ידי שטיפה עם אתנול 70%, ואחריו צנטריפוגה מחדש גלולה את ה-DNA ^3. DNA הוא מחדש המרחפים במים מזוקקים או החיץ של בחירה, לכמת ומאוחסנים ב -20 ° C. ה-DNA מטוהרים יכול לאחר מכן לשמש ביישומים במורד הזרם אשר כוללים, אך לא מוגבלים, PCR, גנומית השוואתי מערך הכלאה ⁴ (מערך CGH), immunoprecipitation DNA מפוגל (MeDIP) וסדר, המאפשר ניתוח אינטגרטיבי של דגימות רקמה / גידול.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. פרוצדורלי מציין</p><ul><li> קסילן פנול הם כימיקלים רעילים צריך להיות מטופל fumehood. עיין בגיליון בטיחות נתונים החומר (MSDS) לפני השימוש.</li><liקסילן> מתמוסס פלסטיים מסוימים; צינורות פוליפרופילן צריך לשמש להם לסבול התרכובות הללו.</li><li> טיפים מיוחדים ניתן לרכוש המכילים פחם פקק פנימי. הדבר מונע מן קסילן המסת כל רכיבי גומי פיפטה. לחלופין, טיפים מסנן ניתן להשתמש.</li></ul><p class="jove_title"> 2. הסרת פרפין</p><ol><li> ב fumehood, מוסיפים 800 μl של קסילן (VWR, CABDH6216-4) על צינור שכותרתו המכיל הדגימה שלך במקום על כיסא נדנדה עם רעד עדין במשך 5 עד 15 דקות לפרק את פרפין.</li><li> גלולה המדגם על ידי ספינינג על מהירות מרבית (14,000 סל"ד או 16 000 XG) ב microcentrifuge במשך 3 דקות. בזהירות למשוך את supernatant קסילן להיפטר בצינור פוליפרופילן עבור להשליך פסולת קסילן. היזהר לא להפריע גלולה.</li><li> חזור על שלבים 1 ו לשטוף קסילן פרפין 2until נמס לגמרי. זה בדרך כלל דורש 2-3 שוטף, בהתאם לגודל המדגם רקמות. מדגם מומס לחלוטין יופיעו רכה, לעתים לאבד את השלמות המבנית שלה. שלמות של המדגם ניתן להעריך בעדינות עם קצה פיפטה.</li></ol><p class="jove_title"> 3. אתנול התייבשות</p><ol><li> הוסף 800 μl של 100% אתנול (v / v) ביולוגיה מולקולרית כיתה אתנול, מערבולת, אז ספין במשך 3 דקות 14,000 סל"ד ב microcentrifuge. הסר את supernatant אתנול, נזהר לא להפריע גלולה.</li><li> הוסף 800 μl של אתנול 70% (100% (v / v) אתנול מדולל במים מזוקקים (ד"ה₂ O)), מערבולת, ואת הספין במשך 3 דקות 14,000 סל"ד. הסר בזהירות את supernatant אתנול.</li><li> הוסף 800 μl של אתנול 50% (100% (v / v) אתנול מדולל במים מזוקקים (ד"ה₂ O)), מערבולת, ואת הספין במשך 5 דקות בסל"ד 14,000. מוציאים בזהירות כמו אתנול רב ככל האפשר על ידי pipetting. היזהר מאוד מטריד את הכדור בנקודה זו כמו רקמה rehydrated מלא לא גלולה, כמו גם רקמות מיובש.</li><li> לאחר הסרת supernatant אתנול, אוויר יבש את הכדור במשך 5 דקות, נזהרים לא יבש מעל.</li></ol><p class="jove_title"> 4. רקמות העיכול</p><ol><li> הוסף 200-500 μl של הצפת תמוגה (הנוסחה להלן). Re-להשעות גלולה באמצעות קצה פיפטה או מערבולת. מאמץ נוסף בשלב זה באופן מלא מחדש להשעות הרקמה תגרום לעיכול שלם יותר של המדגם תשואה טובה יותר של DNA.</li><li> דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים או לחסום חימום.</li><li> עבור ליבות רקמות, ספייק 20 μl של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות, Invitrogen, AM2548) בוקר וערב.</li><li> חזור על הצעדים לעיל לעיכול עבור 2 עד 5 ימים עד רקמת נמס לגמרי.</li></ol><p class="jove_step"> תמוגה הצפת</p<ul><li> 10 mM טריס-HCl pH 8.0</li><li> 100 mM EDTA-pH 8.0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> 0.5% SDS</li><li> 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K (להוסיף רק לפני השימוש)</li></ul><p class="jove_title"> 5. ה-DNA לנקות</p><ol><li> הוסף נפח שווה של חיץ רווי פנול (פישר, BP1750I-400) ומערבבים על ידי היפוך. ספין לפחות 5 דקות 14,000 סל"ד ב microcentrifuge.</li><li> מעבירים את השכבה המימית לצינור חדש. שים לב שלבי הביניים: האם יש הרבה חומר לבן?</li><li> חזור על שלבים 1 ו -2 על השבר מימית עד שלבי הביניים ברור (בדרך כלל 3 פעמים או יותר). בצע בחזרה עקירות * כאשר שלבי הביניים מטושטשת להגדיל את התשואה הסופית.</li><li> לאחר שלבי הביניים ברור, מוסיפים נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:24:1) (פישר, BP1752I-400) לשבר מימית חילוץ של המדגם שלך. מערבבים במשך 5 דקות ואחר כך להסתובב במשך 5 דקות ב 14,000 סל"ד. Thisreduces שיורית פנול נוספת מחדדת את שלבי הביניים, להקל על החילוץ של השכבה המימית</li><li> הסרת שכבה מימית לצינור חדש treatwith RNase על 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​לשעה 1 ב 37 ° C.</li><li> חזור על שלבים 1-4 כדי להסיר כל RNase שנותרו לאסוף את חלק מימית. אתה צריך רק צריך 1 או 2 חיץ צעדים פנול רווי כמו שצריך להיות הרבה פחות חלבון כדי להסיר מאשר lysate הראשונית.</li></ol><p class="jove_content"> * כדי לבצע חזרה עקירות להוסיף 50-100 μl של DH₂ 0 עד הצינור מדגם המכיל את שלבי הביניים ואת חלק אורגני. הפוך את הצינור כדי לערבב ספין מדגם ב 14,000 סל"ד ב microcentrifuge במשך 5 דקות. אסוף את השלב מימית ולהוסיף אותו החילוץ מימית רכשה בעבר. המשך חזרה עקירות עד שלבי הביניים ברור.</p><p class="jove_title"> 6. ה-DNA משקעים</p><ol><li> אומדן היקף שכבה מימית שנאספו שלך.</li><li> הוסף 1 / 10 נפח 3 pH נתרן אצטט M 5.2 ו – 1 נפח של 100% isopropanol כיתה (v / v) ביולוגיה מולקולרית (או 2.5 כרכים של אתנול 100%).</li><li> מערבבים היטב ולשים על הקרח או למקפיא -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לילה.</li><li> ספין במהירות המרבית (14,000 סל"ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות microcentrifuge</li><li> מחק supernatant.</li><li> לשטוף את גלולה עם 70% אתנול קרח קר להסיר מלחים בלתי רצויים.</li><li> Re-להשעות את גלולה במאגר של הבחירה (בדרך כלל DH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. ה-DNA כימות</p><ol><li> לכמת את הריכוז של ה-DNA. A260: A280 היחס צריך להיות ~ 1.8. עבור כמויות קטנות של דנ"א, מדידה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop היא העדיפה.</li><li> בעקבות כימות, ג'ל אלקטרופורזה יש לבצע כדי לבדוק את האיכות של ה-DNA מדגם שלך לקבוע אם RNA לזהם כבר מפורקים לגמרי.</li><li> איכות גבוהה DNA חילוץ כעת מתאים ליישומים במורד הזרם, או יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם רנ"א עדיין קיים במדגם שלך, לחזור על ה-DNA לנקות צעדים משקעים, מחדש לכמת להעפיל את איכות דגימות שלך.</li></ol>

Discussion

רקמות או ביופסיה נכרת בניתוח לניתוח אבחון היסטופתולוגיות ולעתים קרובות קבוע בפורמלין מוטבע פרפין (FFPE) עבור אחסון לטווח ארוך. עם העניין הגובר בהבנת הבסיס הגנטי של המחלה, היכולת להפיק דנ"א מדגימות אלה מהווה מקור רב ערך של חומר אבחון שיכולות לשמש לניתוח גנומי מחקרים translational. היסטורית דגימות FFPE לא נחשבו למקור קיימא עבור ניתוח מולקולרי כמו חומצות גרעין עשוי להיות שונה במידה רבה על ידי חומצה חלבון גרעין חלבונים לחצות קישור ^6. עם זאת, הגילוי כי מערכת העיכול פרוטאז משחרר חומצות גרעין מקוטע אשר מתאימים מנתח במורד הזרם כולל PCR, מערך CGH, רצף פרופיל המתילציה, מאפשר שימוש בדגימות אלה חשובים לניתוח גנטי ^6.

מיצוי דנ"א פרפין, מוטבע רקמות היא הליך חזקים המסתמכת על מסיסות ההפרש לטהר את ה-DNA. DNA חולץ איכות וכמות ואת ההצלחה של הגברה DNA הבאים תלויה במספר פרמטרים לפני, במהלך ואחרי החילוץ. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל: סוג וכמות הרקמה, סוג של מקבע משמש לשימור רקמות, משך קיבעון, גיל של גוש פרפין תנאי האחסון, כמו גם את אורכו של קטע ה-DNA הרצוי להיות מוגבר ^1,7. הסרת פרפין מרקמות הוא השלב הקריטי ביותר להפקת מוצלח כמו פרפין שלא נמס מוביל באיכות דגימה עניים עיכוב הגברה PCR.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–