遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Summary

このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。

Abstract

病気の発生と進行は染色体再配列、コピー数の損益およびDNAメチル化を含む頻繁な遺伝とエピジェネティックな異常によって特徴付けられる。マイクロアレイのような高スループット、ゲノムワイドなプロファイリング技術、、の進歩は著しく、これらの特定の変化を識別して検出するために我々の能力を改善している。技術が向上し続けているしかし、制限要因は、サンプルの品質と可用性のまま。また、フォローアップ臨床情報と疾患の転帰は、しばしば数年、最初の検体採取後に収集されます。検体は、通常、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）、数十年の年間入院アーカイブに格納されています。抽出の適切な方法が適用されている場合、DNAが効率的かつ効果的にパラフィン包埋標本から回収することができます。適切に維持され、保存された検体から抽出した高品質のDNAは正常と病変組織との遺伝的およびエピジェネティックな署名の生成¹の比較のために定量的なアッセイをサポートすることができます。パラフィン包埋サンプル、組織のコアやマイクロダイセクション組織からDNAを抽出するために組織からパラフィンを溶解するキシレン処理に供してから、エタノールの一連の洗浄を使用して再水和されています。タンパク質やヌクレアーゼなどの有害な酵素は、その後、プロテイナーゼK、などのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような変性剤を含む消化^2を容易に溶解バッファーの添加によって消化されています。核酸は、二相溶液を生成するバッファー飽和フェノールと高速の遠心分離を用いて組織ライセートから精製されています。タンパク質、脂質、多糖類の間と有機相のそれぞれに隔離されている間にDNAとRNAは、上部の水相に残る。水相と繰り返しフェノール抽出の保持は、きれいなサンプルが生成されます。フェノール抽出に続いて、RNアーゼAは、汚染RNAを除去するために追加されます。追加のフェノール抽出は、RNaseのインキュベーション後の、残りの酵素を除去するために使用されています。酢酸ナトリウムとイソプロパノール沈殿DNA、および高速の遠心分離の加算は、ペレットにDNAを使用し、イソプロパノール除去を促進しています。過剰な塩は、再ペレットに遠心分離によってDNA ³続いて、その後の酵素アッセイに干渉することができますが、70％エタノールで洗浄することによりDNAから除去することができる沈殿から引き継が。 DNAは、蒸留水または任意の緩衝液に再懸濁し、定量化し、-20℃で保存されています精製したDNAが続いて含まれて下流のアプリケーションで使用できる、限定されるものではないが、PCR、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション^4（アレイCGH）、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）と組織/腫瘍サンプルの統合的な解析を可能にする、シークエンシング。

Protocol

<p class="jove_title"> 1。操作上の留意事項</p><ul><li>キシレンとフェノールは有害な化学物質であり、fumehoodで処理する必要があります。使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。</li><li>キシレンは、特定のプラスチックを溶かして、彼らはこれらの化合物を許容するようにポリプロピレンチューブを使用する必要があります。</li><li>特別なヒントは、内部の木炭のストッパーが含まれている購入してもよい。これにより、ピペット内の任意のゴム成分を溶解からキシレンを防ぎます。また、フィルター付きチップを使用することができます。</li></ul><p class="jove_title"> 2。パラフィン除去</p><ol><li> fumehoodでは、パラフィンを溶解するために5〜15分間穏やかに振盪しながらロッカー上に試験片と場所を含むラベルの付いたチューブにキシレンの800μlを（VWR、CABDH6216 – 4）を追加。</li><li>ペレット3分間微量遠心機で最高速度（14,000 rpmまたは16 000 × g）で回転させてサンプル。慎重にキシレン上清を撤回し、キシレン廃棄物の廃棄のためにポリプロピレンチューブに処分する。ペレットを乱さないように注意してください。</li><li>繰り返しキシレン洗浄ステップ1と2untilパラフィンが完全に溶解させる。これは通常、組織サンプルのサイズに応じて、2〜3回の洗浄が必要です。完全に溶解したサンプルはソフト表示され、そして時には、その構造的な整合性を失うことになる。サンプルの完全性は、ピペットチップで評価することができます。</li></ol><p class="jove_title"> 3。エタノールの水分補給</p><ol><li> 100％エタノール（v / v）の分子生物学グレードのエタノール、渦の800μlのを追加し、微量遠心機で14,000 rpmで3分間スピン。ペレットを乱さないように注意しながら、エタノールの上清を取り除く。</li><li> 70％エタノール800μlを（100％（v / v）の蒸留水で希釈したエタノールを（DH追加₂ O））、渦、そして14,000 rpmで3分間スピン。注意深くエタノールの上清を取り除く。</li><li> 50％エタノール800μlを（100％（v / v）の蒸留水で希釈したエタノールを（DH追加₂ O））、渦、そして14,000 rpmで5分間スピン。注意深くピペッティングでできるだけ多くのエタノールとして削除する。完全に再水和組織意志ではないペレットだけでなく、乾燥組織として、この時点でペレットを乱さないのは十分に注意してください。</li><li>ではない乾燥した上に注意して、5分間エタノールの上清、空気乾燥したペレットを除去した後。</li></ol><p class="jove_title"> 4。組織消化</p><ol><li>溶解バッファー（下式）の200〜500μLを追加する。ペレットは、ピペットチップまたはボルテックスを用いて再懸濁する。完全に再サスペンド組織は、サンプルのより完全消化し、DNAの優れた収量をもたらすためにこの時点で余分な努力。</li><li> 56でサンプルをインキュベート℃の水浴またはヒートブロックでC。</li><li>組織のコアを、プロテイナーゼK（20 mg / mlのストック溶液、Invitrogen社、AM2548）朝と夜のスパイク20μlのために。</li><li>組織が完全に溶解するまで2〜5日のための消化を上記の手順を繰り返します。</li></ol><p class="jove_step">溶解バッファー</p<ul><li> 10mMトリス- HClをpH8.0の</li><li> 100 mMのEDTA pH8.0の</li><li> 50mMのNaCl</li><li> 0.5％SDS</li><li> 200μg/ mlのプロテ​​イナーゼK（使用直前に追加）</li></ul><p class="jove_title"> 5。 DNAのクリーンアップ</p><ol><li>飽和フェノール（フィッシャー、BP1750I – 400）と転倒混和等量のバッファーを追加します。微量遠心機で14,000 rpmで少なくとも5分間スピン。</li><li>新しいチューブに水層を移す。相間に注意してください：白い物質がたくさんある？</li><li>相間がクリアされるまで（通常は3回以上）水性画分を、ステップ1と2を繰り返します。相間の最終的な収率を高めるためにファジーです抽出*をバック行います。</li><li>相間一度明確に、等量のフェノールを追加さ：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）（フィッシャー、BP1752I – 400）、サンプルの抽​​出水性画分に。 5分間混合し、14,000 rpmで5分間スピン。残留フェノールとさらには水層の抽出を容易に、相間をシャープにThisreduces</li><li37℃で1時間、100μg/ mlの℃で>新しいチューブに水層を除去し、treatwithのRNase A</li><li>残りのRNaseを除去し、水性画分を収集する手順1〜4を繰り返します。最初のライセートでも削除するにははるかに少ないタンパク質があるはずだとして、あなただけの1または2のバッファ飽和フェノールのステップを必要としてください。</li></ol><p class="jove_content"> * DHの50〜100μlを追加抽出をバック実行するには<sub> 2</sub中間相と有機部分を含むサンプルチューブに> 0。ミックス、そして5分間微量遠心機で14,000 rpmでサンプルを回転させるチューブを反転。水相を収集し、以前に取得した水性抽出に追加します。相間が透明になるまで抽出をバック続けます。</p><p class="jove_title"> 6。 DNA沈殿</p><ol><li>あなたの集められた水層の体積を見積もる。</li><li> 1 / 10 3 M酢酸ナトリウムのpHは5.2と100％イソプロパノール（v / v）の分子生物学グレード（または100％エタノールの2.5倍量）の1ボリュームのボリュームを追加します。</li><li>よく混ぜ、30分または一晩氷上でまたは-20℃の冷凍庫に入れて。</li><li4の最高速度で>スピン（14,000 rpm）で℃で10分間微量遠心機で</li><li>上清を捨てる。</li><li>不要な塩を除去するために、70％氷冷エタノールでペレットを洗浄します。</li><li選択肢のバッファ（通常はDHで>再懸ペレット₂ O）。</li></ol><p class="jove_title"> 7。 DNA定量化</p><ol><li> DNAの濃度を定量化する。 A260：A280の比が約1.8である必要があります。 DNAの少量の場合は、光度計分光光度計を用いて測定が好ましい。</li><li>以下の定量化、ゲル電気泳動は、サンプルDNAの品質をテストし、汚染RNAは完全に分解されているかどうかを判断するために実施すべきである。</li><li>高品質抽出されたDNAは、現在のダウンストリームアプリケーションに適し、または後で使用するために-20℃で保存することができます。 RNAはまだあなたのサンプル中に存在する場合、DNAのクリーンアップと沈殿工程、およびサンプルの品質を定量化し、資格を再度繰り返す。</li></ol>

Discussion

病理組織学的解析と診断のための生検または外科的に切除した組織は、長期保管のために頻繁にホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）です。疾患の遺伝的基礎を理解する上で関心の高まりとともに、これらのサンプルからDNAを抽出する能力は、ゲノム解析とトランスレーショナル研究のために使用できる診断材料の貴重なソースを表します。歴史的にFFPEサンプルは、核酸などの分子解析のための実行可能なソースと見なされていなかった大きくタンパク質-核酸と^{6をつなぐ}タンパク質間クロスによって変更される可能性があります。しかし、プロテアーゼ消化は、PCR、アレイCGH、シーケンシングおよびメチル化のプロファイリングを含むダウンストリームの解析に適している断片化核酸を放出することの発見は、遺伝学的解析⁶のこれらの貴重な標本を使用できるようになります。

パラフィン包埋組織からのDNA抽出は、DNAを精製するため、差動溶解性に依存している堅牢な手順です。抽出したDNAの質と量とそれに続くDNA増幅の成功は、抽出作業中および作業後は、パラメータの数に依存しています。これらは、これらに限定されない：組織の種類と量、組織保存のために使用される固定液の種類、に固定、パラフィンブロックと保管条件の年齢だけでなく、所望のDNAセグメントの長さの期間を^1,7を増幅。未溶解パラフィンが悪いサンプルの品質とPCR増幅の阻害につながるとして、組織からのパラフィンの除去は、抽出成功のための最も重要なステップです。

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–