DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Summary

Denna video visar protokoll för DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade material. Detta är en flerdagars förfarande där vävnadssnitt är avparaffinerade med xylen, uppblött med etanol och behandlas med proteinas K för att rena och isolera DNA för efterföljande genspecifika eller genom hela analysen.

Abstract

Sjukdomens utveckling och progression kännetecknas av frekventa genetiska och epigenetiska avvikelser inklusive kromosomala omdisponeringar, kopiera vinster nummer och förluster och DNA-metylering. Framsteg inom high-throughput, genomet hela profilering teknik, såsom mikroarrayer, har avsevärt förbättrat vår förmåga att identifiera och upptäcka dessa specifika förändringar. Men eftersom tekniken fortsätter att förbättras, är en begränsande faktor prov kvalitet och tillgänglighet. Vidare uppföljning klinisk information och sjukdom resultatet är ofta samlas år efter den första provtagning. Prover, är oftast formalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE), lagras på sjukhus arkiv i många år decennier. DNA kan effektivt återhämtat sig från paraffininbäddade provexemplar om lämplig metod för utvinning tillämpas. Hög kvalitet DNA extraherat från bevaras på rätt sätt och förvaras prover kan stödja kvantitativa analyser för jämförelser mellan normala och sjuka vävnader och generering av genetiska och epigenetiska signaturer ^1. För att extrahera DNA från paraffininbäddade prover kärnor vävnad eller microdissected vävnad utsätts för xylen behandling, som löser upp paraffin från vävnaden, och sedan uppblött med hjälp av en serie av etanol tvättar. Proteiner och skadliga enzymer som nukleaser därefter brytas ned av proteinas K. Tillsats av lyseringsbuffert, som innehåller denatureringsmedel som natriumdodecylsulfat (SDS), underlättar matsmältningen ^2. Nukleinsyror renas från vävnaden lysat med buffert-mättade fenol och hög hastighet centrifugering som genererar en bifasisk lösning. DNA och RNA kvar i den övre vattenfasen, medan proteiner, lipider och polysackarider är bundet i mellan och organisk-faser respektive. Lagring av vattenfasen och upprepade fenol extraktioner genererar ett rent prov. Efter fenol extraktioner är RNas En tillsättas för att eliminera kontaminerande RNA. Ytterligare fenol extraktioner efter inkubation med RNas A används för att avlägsna alla återstående enzym. Tillägget av natriumacetat och isopropanol utfällningar DNA, och hög hastighet centrifugering används för att pellets DNA och underlätta isopropanol borttagning. Överskott salter som överförts från nederbörden kan störa efterföljande enzymatiska analyser, men kan tas bort från DNA genom tvättning med 70% etanol, följt av centrifugering att åter pellet DNA ^3. DNA är resuspenderas i destillerat vatten eller buffert val, kvantifieras och förvaras vid -20 ° C. Renat DNA kan sedan användas i efterföljande program som inkluderar, men är inte begränsade till, PCR, array jämförande genomik hybridisering ⁴ (array CGH), T-DNA Immunoprecipitation (MeDIP) och sekvensering, vilket möjliggör en integrerad analys av vävnad / tumörprover.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. PROCEDUREN</p><ul><li> Xylen och fenol är giftiga kemikalier och bör hanteras i ett fumehood. Se den Varuinformationsblad (MSDS) före användning.</li><li> Xylen löser vissa plaster, polypropylen rör bör användas, eftersom de tolererar dessa föreningar.</li><li> Speciella tips kan köpas som innehåller en intern kol propp. Detta förhindrar att xylen från lösa föremål av gummi komponenter i pipetten. Alternativt kan filtrera tips användas.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Paraffin borttagning</p><ol><li> I en fumehood, tillsätt 800 l av xylen (VWR, CABDH6216-4) i de märkta röret med ditt prov och plats på en rocker med försiktig skakning i 5 till 15 minuter att lösa upp paraffin.</li><li> Pellets provet genom att snurra på max hastighet (14.000 rpm eller 16 000 xg) i mikrocentrifug i 3 minuter. Försiktigt dra tillbaka xylen supernatanten och kassera i en polypropylen rör för kasta i xylen avfall. Var noga med att inte störa pelleten.</li><li> Upprepa xylen tvätta steg 1 och 2until paraffin är helt upplöst. Detta kräver vanligtvis två till tre tvättar, beroende på storleken på vävnadsprov. En helt upplöst prov kommer att visas mjuk, och kommer ibland att förlora sin hållfasthet. Integriteten av provet kan försiktigt bedömas med pipettspetsen.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Etanol rehydrering</p><ol><li> Lägg till 800 l på 100% etanol (v / v) molekylärbiologi kvalitet etanol, virvel, sedan snurra i 3 minuter vid 14.000 rpm i mikrocentrifug. Avlägsna etanol supernatanten, försiktigt så att inte störa pelleten.</li><li> Lägg till 800 ìl av 70% etanol (100% (v / v) etanol utspätt i destillerat vatten (dH₂ O)), Vortex, och snurra i 3 minuter vid 14.000 rpm. Ta försiktigt bort etanolen supernatanten.</li><li> Lägg till 800 ìl av 50% etanol (100% (v / v) etanol utspätt i destillerat vatten (dH₂ O)), Vortex, och snurra i 5 minuter vid 14.000 rpm. Ta försiktigt bort så mycket etanol som möjligt genom att pipettera. Var ytterst försiktig med att störa pelleten vid denna punkt som helt uppblött vävnad kommer inte pellets samt uttorkad vävnad.</li><li> Efter att etanolen supernatanten, lufttorka pelleten i 5 minuter, försiktigt så att inte mer än torka.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Tissue matsmältningen</p><ol><li> Lägg till 200-500 ìl lyseringsbuffert (formel nedan). Återsuspendera pelleten med hjälp av en pipett spets eller en virvel. Extra insats på denna punkt för att till fullo återsuspendera vävnaden kommer att resultera i en mer fullständig nedbrytning av provet och ett bättre utbyte av DNA.</li><li> Inkubera prov vid 56 ° C i ett vattenbad eller värmeblock.</li><li> För vävnad kärnor, Spike 20 ìl proteinas K (20 mg / ml stamlösning, Invitrogen, AM2548) morgon och kväll.</li><li> Upprepa ovanstående matsmältningen steg 2 till 5 dagar tills vävnaden är helt upplöst.</li></ol><p class="jove_step"> Lyseringsbuffert</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li><li> 100 mM EDTA pH 8,0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> 0,5% SDS</li><li> 200 mikrogram / ml proteinas K (lägg omedelbart före användning)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA städa upp</p><ol><li> Lägg till en lika stor volym buffert mättade fenol (Fisher, BP1750I-400) och blanda genom inversion. Spin i minst 5 minuter vid 14.000 rpm i mikrocentrifug.</li><li> Överför vattenskiktet till ett nytt rör. Notera interfas: Finns det en massa vitt material?</li><li> Upprepa steg 1 och 2 på vatten bråkdel tills faserna är klart (vanligtvis 3 eller fler gånger). Utför tillbaka extraktioner * när faserna är suddig för att öka slutliga avkastning.</li><li> När interfas är klart, tillsätt en lika stor volym av fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) till den extraherade vattenlösning bråkdel av ditt prov. Blanda i 5 minuter och sedan snurrar i 5 minuter vid 14.000 rpm. Thisreduces kvarvarande fenol och ytterligare skärper interfas, underlätta extraktion av vattenskiktet</li><li> Ta bort vattenskiktet till ett nytt rör och treatwith RNas A vid 100 mikrogram / ml under 1 timme vid 37 ° C.</li><li> Upprepa steg 1 till 4 för att ta bort eventuella kvarvarande RNase A och samla vattenfasen fraktion. Du ska bara behöva 1 eller 2 buffert mättade fenol steg som det bör vara mycket mindre protein för att ta bort än i den första lysat.</li></ol><p class="jove_content"> * För att utföra tillbaka extraktioner lägga 50-100 ìl dH₂ 0 till provröret som innehåller faserna och organiska delen. Vänd röret till mixen, och snurra provet vid 14.000 rpm i mikrocentrifug i 5 minuter. Samla vattenfasen och lägga till det tidigare förvärvade extraktion i vatten. Fortsätt sedan extraktioner tills faserna är klart.</p><p class="jove_title"> 6. DNA nederbörd</p><ol><li> Uppskatta volymen på din samlats vattenskiktet.</li><li> Lägg 1 / 10 av volymen av 3 M natriumacetat pH 5,2 och 1 volym av 100% isopropanol (v / v) molekylärbiologi betyg (eller 2,5 volymer av 100% etanol).</li><li> Blanda väl och lägg på is eller i en -20 ° C frys i 30 minuter eller över natten.</li><li> Snurra på maximalt varvtal (14.000 rpm) vid 4 ° C i mikrocentrifug i 10 minuter</li><li> Kasta bort vätskefasen.</li><li> Tvätta pelleten med 70% iskall etanol för att ta bort oönskade salter.</li><li> Återuppslamma pelleten i bufferten av val (vanligtvis dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. DNA-kvantifiering</p><ol><li> Kvantifiera koncentrationen av DNA. Den A260: A280 förhållandet skall vara ~ 1,8. För små mängder DNA, är mätning med en NanoDrop spektrofotometer föredra.</li><li> Efter kvantifiering, gelelektrofores bör utföras för att testa kvaliteten på din prov-DNA och avgöra om förorena-RNA har helt förstörts.</li><li> Hög kvalitet extraherat DNA är nu lämplig för tillämpningar i efterföljande led, eller kan förvaras vid -20 ° C för senare användning. Om RNA är fortfarande kvar i ditt prov, upprepa DNA städa upp och steg nederbörd, och åter kvantifiera och kvalificera kvaliteten på dina prover.</li></ol>

Discussion

Biopsier eller kirurgiskt exciderad vävnader för histopatologiska analys och diagnos är ofta formalin fasta och paraffininbäddade (FFPE) för långtidsförvaring. Med det växande intresset för att förstå den genetiska grunden för sjukdomen, representerar förmågan att extrahera DNA från dessa prover en ovärderlig källa till diagnostiskt material som kan användas för genomisk analys och translationell studier. Historiskt FFPE proven ansågs inte en livskraftig källa för molekylär analys som nukleinsyror kan vara kraftigt modifierad av protein-nukleinsyra och protein-protein cross länkning ^6. Men gör upptäckten att proteas matsmältningen frigör fragmenterade nukleinsyror som är lämpliga för efterföljande analyser inklusive PCR, array CGH, sekvensering och metylering profilering användningen av dessa värdefulla prover för genetisk analys ^6.

DNA-extraktion från paraffininbäddade vävnader är ett stabilt förfarande som bygger på differentiell löslighet att rena DNA. Extraherade DNA-kvalitet och kvantitet och framgången för efterföljande DNA-amplifiering är beroende av ett antal parametrar före, under och efter extraktion. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till: typ och mängd av vävnad, vilken typ av fixativ som används för vävnad bevara, hur länge till upptagning, ålder paraffin block och lagringsförhållanden samt längden på önskat DNA-segment kan förstärks ^1,7. Borttagning av paraffin från vävnaden är det mest kritiska steget för en lyckad extraktion som oupplöst paraffin leder till dålig prov kvalitet och hämning av PCR-amplifiering.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–