Extraction d'ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Summary

Cette vidéo montre le protocole d'extraction d'ADN à partir du matériel fixé au formol et inclus en paraffine. Ceci est une procédure de plusieurs jours dans lequel des coupes de tissus sont déparaffinées avec du xylène, réhydratée avec de l'éthanol et traités à la protéinase K pour purifier et d'isoler l'ADN pour l'analyse des gènes spécifiques ou du génome à l'échelle suivante.

Abstract

Le développement et la progression de la maladie sont caractérisés par de fréquentes aberrations génétiques et épigénétiques dont les réarrangements chromosomiques, les gains et pertes du nombre de copies et de méthylation de l'ADN. Les progrès de la haut-débit, les technologies de profilage du génome entier, comme les microréseaux, ont considérablement amélioré notre capacité d'identifier et de détecter ces altérations spécifiques. Cependant, comme la technologie continue de s'améliorer, un facteur limitant reste la qualité de l'échantillon et de disponibilité. Par ailleurs, le suivi des informations cliniques et évolution de la maladie sont souvent recueillies ans après le prélèvement de l'échantillon initial. Les spécimens, généralement fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), sont stockés dans les archives de l'hôpital pour les années à plusieurs décennies. L'ADN peut être efficacement et effectivement récupérés à partir des échantillons inclus en paraffine, si la méthode appropriée d'extraction est appliquée. L'ADN de haute qualité extraite à partir de spécimens bien conservés et stockés peuvent soutenir dosages quantitatifs pour les comparaisons des tissus normaux et malades et la génération de signatures génétiques et épigénétiques ^1. Pour extraire l'ADN à partir d'échantillons inclus en paraffine, les carottes de tissus ou de tissus microdisséquées sont soumis à un traitement xylène, qui dissout la paraffine du tissu, puis réhydratée en utilisant une série de lavages éthanol. Protéines et des enzymes nuisibles tels que les nucléases sont ensuite digérées par la protéinase K. L'ajout de tampon de lyse, qui contient des agents dénaturants tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS), facilite la digestion ^2. Les acides nucléiques sont purifiés à partir du lysat de tissu à l'aide du tampon saturé centrifugation à vitesse élevée de phénol et qui génère une solution biphasique. ADN et ARN restent dans la phase aqueuse supérieure, tandis que les protéines, les lipides et les polysaccharides sont séquestrés dans les inter-et bio-phases, respectivement. Conservation de la phase aqueuse et répétée extractions au phénol génère un échantillon propre. Après extractions au phénol, RNase A est ajouté pour éliminer l'ARN contaminant. D'autres extractions au phénol après incubation avec de la RNase A sont utilisés pour éliminer toute enzyme restante. L'ajout d'acétate de sodium et de l'ADN précipite l'isopropanol, et centrifugation à grande vitesse est utilisé pour agglomérer l'ADN et de faciliter le retrait d'isopropanol. L'excès de sel reportés de précipitations peuvent interférer avec les dosages enzymatiques ultérieures, mais peut être retiré de l'ADN par lavage à l'éthanol à 70%, suivie par une centrifugation de re-pellets l'ADN ^3. L'ADN est remis en suspension dans l'eau distillée ou du tampon de choix, quantifiés et conservés à -20 ° C. ADN purifié peut ensuite être utilisé dans des applications en aval qui incluent, mais ne sont pas limités à, PCR, hybridation génomique comparative ⁴ (CGH array), immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP) et le séquençage, permettant une analyse intégrative des échantillons de tissu / tumeur.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Notes de procédure</p><ul><li> Le xylène et le phénol sont des produits chimiques toxiques et doivent être manipulés dans une hotte. Se référer à la fiche de données sécurité (FDS) avant utilisation.</li><liXylène> dissout certains plastiques, tubes en polypropylène doit être utilisé comme elles tolèrent ces composés.</li><liConseils> spéciaux peuvent être achetés qui contiennent un bouchon de charbon de bois interne. Ceci empêche le xylène de dissoudre tous les composants en caoutchouc dans la pipette. Alternativement, bouts filtres peuvent être utilisés.</li></ul><p class="jove_title"> 2. L'enlèvement de paraffine</p><ol><li> Dans une hotte, ajouter 800 ul de xylène (VWR, CABDH6216-4) au tube étiqueté contenant votre spécimen et le placer sur un rocker en agitant doucement pendant 5 à 15 minutes pour dissoudre la paraffine.</li><li> Pellet l'échantillon en faisant tourner à la vitesse maximale (14 000 rpm ou 16 000 xg) dans une microcentrifugeuse pendant 3 minutes. Soigneusement retirer le surnageant xylène et d'en disposer dans un tube en polypropylène pour jeter dans les déchets xylène. Attention à ne pas perturber le culot.</li><li> Répétez les étapes 1 et lavez le xylène paraffine 2until est entièrement dissous. Cela nécessite généralement deux à trois lavages, selon la taille de l'échantillon de tissu. Un échantillon entièrement dissoute apparaîtra doux, et parfois perdre son intégrité structurale. L'intégrité de l'échantillon peut être évaluée avec douceur une pointe de pipette.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Réhydratation éthanol</p><ol><li> Ajouter 800 ul d'éthanol à 100% (v / v) de l'éthanol moléculaires de biologie, vortex, puis tourner pendant 3 minutes à 14000 rpm dans microcentrifugeuse. Retirer le surnageant d'éthanol, en faisant attention à ne pas perturber le culot.</li><li> Ajouter 800 ul d'éthanol à 70% (100% (v / v) d'éthanol dilué dans l'eau distillée (dH₂ O)), vortex et spin pour 3 minutes à 14000 rpm. Retirer délicatement le surnageant d'éthanol.</li><li> Ajouter 800 ul d'éthanol à 50% (100% (v / v) d'éthanol dilué dans l'eau distillée (dH₂ O)), vortex et spin pour 5 minutes à 14000 rpm. Retirez délicatement comme l'éthanol autant que possible par pipetage. Soyez extrêmement prudent de perturber le culot à ce point que le tissu ne sera pas complètement réhydraté pellets ainsi que les tissus déshydratés.</li><li> Après avoir retiré le surnageant d'éthanol, sécher à l'air le culot pendant 5 minutes, en faisant attention de ne pas trop sec.</li></ol><p class="jove_title"> 4. La digestion des tissus</p><ol><li> Ajouter 200 à 500 ul de tampon de lyse (formule ci-dessous). Re-suspendre le culot à l'aide d'une pipette ou d'un vortex. Des efforts supplémentaires à ce stade entièrement re-suspendre les tissus se traduira par une digestion plus complète de l'échantillon et un meilleur rendement de l'ADN.</li><li> Incuber les échantillons à 56 ° C dans un bain-marie ou bloc de chauffage.</li><li> Pour des noyaux des tissus, pointe 20 pl de la protéinase K (20 mg / ml de solution concentrée, Invitrogen, AM2548) matin et soir.</li><li> Répétez les étapes ci-dessus la digestion de 2 à 5 jours jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissous.</li></ol><p class="jove_step"Lysis Buffer></p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li><li> 100 mM EDTA pH 8,0</li><li> 50 mM de NaCl</li><li> 0,5% de SDS</li><li> 200 pg / ml de protéinase K (ajouter juste avant utilisation)</li></ul><p class="jove_title"> 5. L'ADN nettoyer</p><ol><li> Ajouter un volume égal de phénol saturé de tampon (Fisher, BP1750I-400) et mélanger par retournement. Spin pendant au moins 5 minutes à 14000 rpm dans microcentrifugeuse.</li><li> Transfert de la couche aqueuse dans un nouveau tube. Notez l'interphase: est ce qu'il ya beaucoup de matière blanche?</li><li> Répétez les étapes 1 et 2 sur la fraction aqueuse jusqu'à ce que l'interphase est clair (en général 3 fois ou plus). Effectuer des extractions de retour * lorsque l'interphase est floue pour augmenter le rendement final.</li><li> Une fois l'interphase est clair, ajouter un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25/24/1) (Fisher, BP1752I-400) à la fraction aqueuse extraite de votre échantillon. Mélangez pendant 5 minutes, puis tourner pendant 5 minutes à 14000 rpm. Thisreduces résiduelles de phénol et d'autres aiguise l'interphase, ce qui facilite l'extraction de la couche aqueuse</li><li> Retirer la couche aqueuse dans un nouveau tube et treatwith RNase A à 100 pg / ml pendant 1 heure à 37 ° C.</li><li> Répétez les étapes 1 à 4 pour supprimer tout reste RNase A et recueillir la fraction aqueuse. Vous ne devriez avoir besoin 1 ou 2 tampons saturés étapes phénol comme il devrait y avoir beaucoup moins de protéines à éliminer que dans le lysat initiale.</li></ol><p class="jove_content"> * Pour effectuer des extractions de retour ajoutez 50-100 ul de DH₂ 0 dans le tube contenant l'échantillon de l'interphase et la fraction organique. Inverser le tube pour mélanger, et le spin de l'échantillon à 14 000 rpm dans une microcentrifugeuse pendant 5 minutes. Recueillir la phase aqueuse et l'ajouter à l'extraction aqueuse précédemment acquis. Continuer jusqu'au retour des extractions de l'interphase est claire.</p><p class="jove_title"> 6. L'ADN des précipitations</p><ol><li> Estimation du volume de votre couche aqueuse recueillie.</li><li> Ajouter 1 / 10 du volume de 3 M pH 5,2 acétate de sodium et 1 volume de 100% d'isopropanol (v / v) de qualité de biologie moléculaire (ou 2,5 volumes d'éthanol 100%).</li><li> Mélangez bien et mettez sur la glace ou dans un congélateur à -20 ° C pendant 30 minutes ou toute la nuit.</li><liSpin> à la vitesse maximale (14 000 rpm) à 4 ° C dans microcentrifugeuse pendant 10 minutes</li><li> Jeter le surnageant.</li><li> Laver le culot avec de l'éthanol à 70% de la glace froide pour éliminer les sels indésirables.</li><li> Re-suspendre le culot dans le tampon de choix (généralement dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. Quantification de l'ADN</p><ol><li> Quantifier la concentration de l'ADN. L'A260: A280 ratio devrait être ~ 1,8. Pour des petites quantités d'ADN, mesure à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop est préférable.</li><liQuantification> Après, l'électrophorèse sur gel devrait être effectué afin de tester la qualité de votre échantillon d'ADN et de déterminer si la contamination ARN a été complètement dégradée.</li><li> Haute qualité ADN extrait est maintenant adapté aux applications en aval, ou peuvent être conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Si l'ARN est toujours présent dans votre échantillon, répéter l'ADN de nettoyage et des étapes de précipitation, et re quantifier et qualifier la qualité de vos échantillons.</li></ol>

Discussion

Tissus biopsiés ou chirurgicalement excisés pour l'analyse et le diagnostic histopathologique sont souvent fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) pour le stockage à long terme. Avec l'intérêt croissant dans la compréhension des bases génétiques de la maladie, la capacité d'extraire l'ADN de ces échantillons représente une source inestimable de matériel de diagnostic qui peut être utilisé pour l'analyse génomique et les études translationnelles. Historiquement échantillons FFPE n'étaient pas considérés comme une source viable pour l'analyse moléculaire des acides nucléiques peuvent être fortement modifiées par la protéine-acide nucléique et des protéines-protéines réticulation ^6. Cependant, la découverte que la digestion de protéase communiqués fragmenté acides nucléiques qui sont adaptés pour des analyses en aval, y compris la PCR, CGH array, le séquençage et le profilage de méthylation, permet l'utilisation de ces spécimens précieux pour l'analyse génétique ^6.

L'extraction d'ADN à partir des tissus inclus en paraffine est une procédure robuste qui s'appuie sur la solubilité différentielle pour purifier l'ADN. La qualité et la quantité d'ADN extrait et le succès de l'amplification d'ADN ultérieures dépend d'un certain nombre de paramètres avant, pendant et après l'extraction. Il s'agit notamment, mais sans s'y limiter: le type et la quantité de tissu, le type de fixateur utilisé pour la conservation des tissus, la durée de fixation, l'âge du bloc de paraffine et les conditions de stockage, ainsi que la longueur du segment d'ADN voulu être amplifiée ^1,7. Retrait de la paraffine du tissu est l'étape la plus critique pour l'extraction de succès que la paraffine non dissous conduit à la qualité des échantillons pauvres et l'inhibition de l'amplification par PCR.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–