L'activation de l'apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons la micro-injection directe cytoplasmique du cytochrome<em> C</emProtéines> dans des fibroblastes primaires et des neurones sympathiques. Cette technique permet l'introduction du cytochrome<em> C</emProtéines> dans le cytoplasme des cellules et imite la libération du cytochrome<em> C</em> À partir de mitochondries, ce qui se produit lors de l'apoptose.
Abstract
L'apoptose ou mort cellulaire programmée, est une voie conservées et très réglementé par lequel les cellules meurent 1. L'apoptose peut être déclenchée quand les cellules rencontrent une large gamme de contraintes cytotoxiques. Ces insultes provoquent des cascades de signalisation qui finissent par provoquer la libération du cytochrome c de l'espace intermembranaire mitochondrial vers le cytoplasme 2. La libération du cytochrome c de la mitochondrie est un événement clé qui déclenche l'activation rapide des caspases, les protéases cellulaires clés qui finalement exécuter la mort cellulaire 3-4.
La voie de l'apoptose est régulée dans les points amont et aval de la libération du cytochrome c à partir de 5 mitochondries. Afin d'étudier la régulation post-mitochondrial de l'activation des caspases, de nombreux chercheurs se sont tournés vers la micro-injection cytoplasmique directe de holocytochrome c (hème-jointe) de protéines dans les cellules 6-9. Cytochrome c est normalement localisée dans les mitochondries, où l'attachement d'un groupe hème est nécessaire pour lui permettre d'activer l'apoptose 10-11. Par conséquent, pour activer directement les caspases, il est nécessaire d'injecter la protéine holocytochrome c au lieu de son ADNc, parce que l'expression du cytochrome c de constructions d'ADNc se traduira dans le ciblage mitochondrial et l'attachement hème, il sera séquestré par les caspases cytosolique. Ainsi, la micro-injection directe cytosolique de la protéine purifiée hème-joint le cytochrome c est un outil utile pour imiter cytochrome c mitochondrial libération et l'apoptose sans l'utilisation d'agressions toxiques qui provoquent des dommages cellulaires et mitochondriales.
Dans cet article, nous décrivons une méthode pour la microinjection du cytochrome c de protéines dans les cellules, en utilisant la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) et primaires neurones sympathiques comme exemples. Alors que ce protocole met l'accent sur l'injection de cytochrome c pour les enquêtes de l'apoptose, les techniques présentées ici peuvent également être facilement adapté à la micro-injection d'autres protéines d'intérêt.
Protocol
Discussion
La micro-injection de cytochrome c directement dans le cytoplasme des cellules est un outil unique et puissant qui permet d'études de la régulation post-mitochondriale de l'apoptose. Fait important, cette technique permet l'activation directe de l'apoptose aval de la mitochondrie, sans l'utilisation d'agents qui causent des dommages cellulaires ou mitochondriales.
Bien que ce protocole a porté sur la microinjection du cytochrome c pour les études…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH NS042197 à MD. AJK a été soutenue par des subventions et des T32GM008719 F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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