Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em
Summary
Neste protocolo, descrevemos a microinjeção direta citoplasmática de citocromo<em> C</em> Proteína em fibroblastos e primário neurônios simpáticos. Esta técnica permite a introdução do citocromo<em> C</em> Proteínas no citoplasma das células e imita a liberação de citocromo<em> C</em> A partir de mitocôndrias, que ocorre durante a apoptose.
Abstract
Apoptose, ou morte celular programada, é uma via conservada e altamente regulado pelo qual as células morrem 1. Apoptose pode ser desencadeada quando as células encontrar uma ampla gama de tensões citotóxicos. Estes insultos iniciar cascatas de sinalização que acaba por causar a liberação de citocromo c do espaço intermembranar mitocondrial para o citoplasma 2. A liberação de citocromo c da mitocôndria é um evento-chave que desencadeia a rápida ativação das caspases, as proteases celular chave que acaba por executar a morte celular 3-4.
A via de apoptose é regulada em pontos a montante ea jusante da liberação do citocromo c da mitocôndria 5. A fim de estudar a regulação pós-mitocondrial de ativação da caspase, muitos pesquisadores se voltaram para a microinjeção citoplasmática direta de holocytochrome c (heme-anexo) de proteína em células 6-9. Citocromo c é normalmente localizada na mitocôndria onde o apego de um grupo heme é necessária para habilitá-lo para ativar a apoptose 10-11. Portanto, para ativar diretamente caspases, é necessário para injetar a proteína c holocytochrome em vez do seu cDNA, porque enquanto a expressão de citocromo c de construções de cDNA resultará em alvo mitocondrial e apego heme, será seqüestrado de caspases citosólica. Assim, a microinjeção direta citosólica purificada heme ligado à proteína do citocromo c é uma ferramenta útil para imitar mitocondrial citocromo c release e apoptose sem o uso de insultos tóxicos que causam dano celular e mitocondrial.
Neste artigo, descrevemos um método para a microinjeção de citocromo c de proteínas em células, usando fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) e primário neurônios simpáticos como exemplos. Embora este protocolo incide sobre a injeção de citocromo c para as investigações da apoptose, as técnicas mostradas aqui também pode ser facilmente adaptado para microinjeção de outras proteínas de interesse.
Protocol
Discussion
A microinjeção de citocromo c diretamente no citoplasma das células é uma ferramenta original e poderosa que permite estudos de regulação pós-mitocondrial da apoptose. Importante, esta técnica permite a ativação direta da apoptose a jusante da mitocôndria sem o uso de agentes que causam dano celular ou mitocondrial.
Embora este protocolo tem se concentrado em microinjeção de citocromo c para estudos sobre apoptose, os princípios gerais da microinjeção de pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder NS042197 a MD. AJK foi suportada por concessões T32GM008719 e F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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