Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em
Summary
In diesem Protokoll, beschreiben wir die direkte zytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom<em> C</em> Protein in Fibroblasten und primäre sympathischen Neuronen. Diese Technik ermöglicht die Einführung von Cytochrom<em> C</em> Protein in das Zytoplasma der Zellen und ahmt die Freisetzung von Cytochrom<em> C</em> Aus den Mitochondrien, die auftritt, während der Apoptose.
Abstract
Apoptose oder der programmierte Zelltod, ist eine konservierte und stark regulierten Weg durch die Zellen sterben 1. Apoptose ausgelöst, wenn die Zellen Begegnung eine breite Palette von zytotoxischen betont werden. Diese Beleidigungen initiieren Signalkaskaden, die letztlich zur Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien Intermembranraum in das Cytoplasma 2. Die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien ist ein wichtiges Ereignis, dass die schnelle Aktivierung von Caspasen, die wichtigsten zellulären Proteasen, die letztlich zum Zelltod führen 3-4 auslöst.
Der Weg der Apoptose wird an den Punkten vor-und nachgelagerten von Cytochrom c Freisetzung aus Mitochondrien 5 geregelt. Um die post-mitochondrialen Regulation der Caspase-Aktivierung Studie haben viele Forscher den direkten cytoplasmatischen Mikroinjektion von Holocytochrom c (Häm-attached)-Protein in Zellen 6-9 gedreht. Cytochrom c ist in der Regel in die Mitochondrien, wo Anbringung eines Häm-Gruppe ist notwendig, damit es zur Apoptose 10-11 aktivieren lokalisiert. Deshalb, um direkt zu aktivieren Caspasen, ist es notwendig, die Holocytochrom c Protein anstelle des cDNA injizieren, denn während die Expression von Cytochrom c aus cDNA-Konstrukte in der mitochondrialen Targeting-und Häm-Anlage führen wird, ist es von der zytosolischen Caspasen beschlagnahmt werden. So ist die direkte cytosolische Mikroinjektion von gereinigtem Häm-attached Cytochrom c-Protein ein nützliches Instrument zur mitochondrialen Cytochrom c Freisetzung und Apoptose, ohne die Verwendung von giftigen Beleidigungen, die zellulären und mitochondrialen Schäden verursachen imitieren.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode für die Mikroinjektion von Cytochrom c-Proteins in Zellen mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) und der primären sympathischen Neuronen als Beispiele. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf die Injektion von Cytochrom c für Untersuchungen der Apoptose, können die hier gezeigten Techniken auch leicht für die Mikroinjektion der andere Proteine von Interesse angepasst werden.
Protocol
Discussion
Die Mikroinjektion von Cytochrom c direkt in das Zytoplasma der Zellen ist ein einzigartiges und leistungsfähiges Werkzeug, das für die Untersuchung der post-mitochondrialen Regulation der Apoptose ermöglicht. Wichtig ist, ermöglicht diese Technik für die direkte Aktivierung der Apoptose stromabwärts von Mitochondrien ohne den Einsatz von Mitteln, die zellulären oder mitochondriale Schäden verursachen.
Während dieses Protokoll auf die Mikroinjektion von Cytochrom c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH NS042197 zu MD unterstützt. AJK wurde durch Zuschüsse T32GM008719 und F30NS068006 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
