Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em
Summary
В этом протоколе описываются прямые цитоплазматические микроинъекции цитохрома<em> С</em> Белка в фибробласты и первичных симпатических нейронов. Эта техника позволяет введение цитохрома<em> С</em> Белков в цитоплазме клетки и имитирует выпуск цитохрома<em> С</em> Из митохондрий, которая происходит во время апоптоза.
Abstract
Апоптоз, или запрограммированная смерть клетки, сохраняется и строго регулируется путь по которому клетки умирают 1. Апоптоз может быть вызван, когда клетки встречи широкий спектр цитотоксического напряжений. Эти оскорбления инициировать сигнальные каскады, которые в конечном итоге вызвать высвобождение цитохрома С из митохондриальных пространства межмембранного в цитоплазму 2. Освобождение цитохрома С из митохондрий является ключевым событием, которое вызывает быструю активацию каспаз, ключ сотовой протеазы, которые в конечном итоге выполнить гибели клеток 3-4.
Путь апоптоза регулируется в точках на входе и выходе системы цитохрома релиз с из митохондрий 5. С целью изучения пост-митохондриальной регуляции активации каспазы, многие исследователи обратились к прямым цитоплазматических микроинъекции holocytochrome с (гем-прилагается) белка в клетках 6-9. Цитохром с, как правило, локализованы в митохондриях, где крепление группы гема Необходимо включить его, чтобы активировать апоптоз 10-11. Поэтому, чтобы непосредственно активировать каспазы, необходимо вводить holocytochrome протеина С, а не его кДНК, потому что в то время как экспрессия цитохрома С из кДНК конструкций приведет к митохондриальной адресности и гема вложений, то это будет поглощенных от цитозольного каспазы. Таким образом, прямой цитозольного микроинъекции очищенной гема подключением белка цитохром с является полезным инструментом, чтобы имитировать митохондриальной цитохром-с-релиз и апоптоз без использования токсичных оскорбления, которые вызывают клеточного и митохондриального повреждения.
В этой статье мы опишем метод микроинъекции белка цитохрома С в клетках, используя мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) и первичных симпатических нейронов в качестве примеров. Хотя этот протокол фокусируется на введении цитохрома С для исследования апоптоза, методы показано здесь также может быть легко адаптирована для микроинъекции других белков, представляющих интерес.
Protocol
Discussion
Микроинъекции цитохром с непосредственно в цитоплазме клеток является уникальным и мощным инструментом, который позволяет для исследования после митохондриальной регуляции апоптоза. Важно отметить, что эта техника позволяет прямой активации апоптоза вниз по течению митохондр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грант NS042197 на MD. AJK была поддержана грантами T32GM008719 и F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
