Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em
Summary
I detta protokoll, beskriver vi den direkta cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom<em> C</em> Protein i fibroblaster och primära sympatiska nervceller. Denna teknik gör det möjligt för införandet av cytokrom<em> C</em> Protein i cytoplasman av celler och härmar frisättningen av cytokrom<em> C</em> Från mitokondrierna, uppstår som under apoptos.
Abstract
Apoptos eller programmerad celldöd, är en bevarad och starkt reglerad väg där celler dör 1. Apoptos kan utlösas när celler möter ett brett spektrum av cytotoxisk påfrestningar. Dessa förolämpningar initiera signalering kaskader som i slutändan orsaka utsläpp av cytokrom c från mitokondriens intermembrane utrymmet till cytoplasman 2. Frisättningen av cytokrom c från mitokondrierna är en viktig händelse som utlöser den snabba aktivering av kaspaser, nyckeln cellulära proteaser som i slutändan köra celldöd 3-4.
Vägen av apoptos regleras i punkterna uppströms och nedströms om cytokrom c befrielse från mitokondrier 5. För att studera efter mitokondriella reglering av kaspasaktivering har många utredare vänt sig till direkt cytoplasmisk mikroinjektion av holocytochrome c (häm-bifogas) protein i cellerna 6-9. Cytokrom c är normalt lokaliserad till mitokondrierna där fastsättning av en heme grupp är nödvändig för att den för att aktivera apoptos 10-11. Därför direkt för att aktivera kaspaser är det nödvändigt att injicera holocytochrome c protein istället för dess cDNA, eftersom medan uttrycket av cytokrom c från cDNA konstruktioner kommer att resultera i mitokondriernas inriktning och heme kvarstad, kommer det att vara upptagits från cytosoliska kaspaser. Således är den direkta cytosoliskt mikroinjektion av renat heme-anslutna cytokrom c protein ett användbart verktyg för att efterlikna mitokondrie cytokrom c release och apoptos utan att använda giftiga förolämpningar som orsakar cellulär och mitokondriell skada.
I den här artikeln beskriver vi en metod för mikroinjektion av cytokrom c protein i cellerna, med musen embryonala fibroblaster (MEFs) och primära sympatiska nervceller som exempel. Även om detta protokoll fokuserar på injektion av cytokrom c för undersökningar av apoptos kan de tekniker som visas här också enkelt anpassas för mikroinjektion av andra proteiner av intresse.
Protocol
Discussion
Det mikroinjektion av cytokrom c direkt i cytoplasman av celler är ett unikt och kraftfullt verktyg som möjliggör studier av post-mitokondriella reglering av apoptos. Viktigt ger denna teknik för direkt aktivering av apoptos nedströms mitokondrier utan användning av agenter som orsakar cellulär eller mitokondriell skada.
Även om detta protokoll har fokuserat på mikroinjektion av cytokrom c för studier av apoptos, kan de allmänna principerna för protein mikroinje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag NS042197 till MD. AJK har finansierats med bidrag T32GM008719 och F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
