Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos
Summary
Un procedimiento simple de vibratome seccionar el órgano de Corti, seguido por microscopía confocal de inmunohistoquímica y se describe. Este procedimiento permite una mejor conservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti de mamíferos, y por lo tanto permite la cuantificación exacta de los tipos de células.
Abstract
El órgano de Corti de mamíferos es un mosaico muy ordenado celular de pelo mechanosensory y apoyo a las células sensoriales
(Revisado en 1,2). La visualización de este mosaico celular a menudo requiere que el órgano de Corti es seccionado. En particular, el pilar sensoriales y las células de Deiters, cuyos núcleos se encuentran basalmente con respecto a las células del cabello, no pueden ser visualizados sin cruz-seccionar el órgano de Corti. Sin embargo, la delicada citoarquitectura del órgano de Corti de mamíferos, incluyendo los procesos citoplásmicos bien de la columna y las células de Deiters, es difícil de mantener por los procedimientos de rutina histológica como la parafina y la crio-corte, que son compatibles con las técnicas estándar de tinción inmunohistoquímica.
Aquí describo un procedimiento simple y robusto, que consiste en seccionar vibratome de la cóclea, la tinción inmunohistoquímica de estas secciones vibratome en el monte entero, seguido por microscopía confocal. Este procedimiento se ha utilizado ampliamente para el análisis immunhistochemical de múltiples órganos, incluyendo la yema del miembro del ratón, pez cebra intestino, el hígado, el páncreas y el corazón (ver 3.6 para algunos ejemplos). Además, este procedimiento fue exitoso para ambas imágenes y quantitificaton del pilar número de células mutantes en los órganos de control y de Corti, tanto en embriones de ratones adultos y 7. Este método, sin embargo, actualmente no se utiliza ampliamente para examinar el órgano de Corti mamíferos. El potencial de este procedimiento tanto para proporcionar una mayor preservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti para adultos y permiten la cuantificación de los diversos tipos de células se describe.
Protocol
Discussion
El procedimiento de corte vibratome, seguido de imágenes de inmunohistoquímica y confocal permite la visualización del órgano de Corti con el mínimo daño a los tejidos. Claramente, las imágenes tomadas de la región confocal interna en la sección vibratome muestran una excelente conservación de la morfología celular que sólo está limitado por artificios de fijación. Confocal de imágenes tomadas cerca de las dos superficies de corte de una sección vibratome son a menudo indistinguibles de las imágenes de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea reconocer el uso del núcleo de la Infancia del Instituto de Investigación de imágenes para la microscopía confocal y el Dr. Jian Zhang a la sugerencia de montar secciones usando perlas de agarosa. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
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