Vibratome sectionnement pour la préservation accrue de la cytoarchitecture de l'Organe de Corti des mammifères
Summary
Une procédure simple de vibratome sectionner l'organe de Corti, suivie par microscopie confocale immunohistochimie et est décrit. Cette procédure permet une meilleure conservation de l'cytoarchitecture amende de l'organe de Corti des mammifères, et permet par conséquent d'une quantification précise des types de cellules.
Abstract
L'organe de Corti des mammifères est une mosaïque très ordonné cellulaires de cheveux et de mécano nonsensory cellules de soutien
(Examiné en 1,2). Visualisation de cette mosaïque cellulaires exige souvent que l'organe de Corti est à section. En particulier, le pilier nonsensory et les cellules de Deiters, dont les noyaux sont situés basale à l'égard des cellules ciliées, ne peuvent être visualisées sans coupes transversales de l'organe de Corti. Toutefois, la cytoarchitecture délicat de l'organe de Corti des mammifères, y compris les processus cytoplasmiques fines du pilier et les cellules de Deiters, est difficile à conserver par la routine des procédures histologiques telles que la paraffine et cryo-coupe, qui sont compatibles avec les techniques standards de coloration immunohistochimique.
Je décris ici une procédure simple et robuste composé de vibratome sectionnement de la cochlée, la coloration immunohistochimique de ces sections vibratome dans la montagne entière, suivie par microscopie confocale. Cette procédure a été largement utilisée pour l'analyse immunohistochimique de multiples organes, y compris le bourgeon de membre de la souris, le poisson-zèbre intestins, le foie, le pancréas et le cœur (voir 3-6 pour des exemples choisis). En outre, cette procédure a été réussie pour les deux imagerie et quantitificaton du nombre de cellules dans les organes des piliers de mutants et de contrôle de Corti à la fois dans les embryons et des souris adultes 7. Cette méthode, cependant, n'est pas largement utilisée pour examiner l'organe de Corti des mammifères. Le potentiel de cette procédure à la fois à assurer la préservation accrue de la cytoarchitecture amende de l'organe de Corti et les adultes permettent de quantifier les différents types de cellules est décrite.
Protocol
Discussion
La procédure de sectionnement vibratome, suivi par imagerie confocale immunohistochimie et permet la visualisation de l'organe de Corti à une lésion tissulaire minime. De toute évidence, les images prises à partir confocale régions internes dans la section vibratome montrent une excellente conservation de la morphologie cellulaire qui n'est limitée que par des artefacts de fixation. Images prises confocale à proximité des deux coupe-surfaces d'une section vibratome sont souvent impossibles à distin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'auteur tient à remercier l'utilisation de Core pour enfants de l'Institut de recherche pour l'imagerie de microscopie confocale et le Dr. Jian Zhang pour la suggestion de monter des sections en utilisant des billes d'agarose. Ce travail a été financé par le NIH octroi DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
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