Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi
Summary
Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell'organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.
Abstract
L'organo di Corti dei mammiferi è un mosaico altamente ordinato cellulari di capelli mechanosensory e nonsensory cellule di supporto
(Recensione a 1,2). Visualizzazione di questo mosaico cellulare spesso richiede che l'organo del Corti è sezionato. In particolare, il pilastro nonsensory e le cellule Deiters ', i cui nuclei si trovano basale rispetto alle cellule dei capelli, non possono essere visualizzati senza cross-sezionare l'organo del Corti. Tuttavia, il delicato citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, inclusi i processi multa citoplasmatica del pilastro e cellule Deiters ', è difficile da conservare per procedure istologiche di routine come la paraffina e crio-sezionamento, che sono compatibili con le tecniche standard di colorazione immunoistochimica.
Qui descrivere una procedura semplice e robusta costituita da vibratome sezionamento della coclea, la colorazione immunoistochimica di queste sezioni vibratome a monte tutto, seguita da microscopia confocale. Questa procedura è stata utilizzata ampiamente per l'analisi immunhistochemical di molti organi, tra cui la gemma dell'arto topo, pesce zebra intestino, fegato, pancreas e cuore (vedi 3-6 per esempi selezionati). Inoltre, questa procedura è stata sucessful sia per l'imaging e quantitificaton del numero di cellule mutanti pilastro di organi e il controllo delle Corti sia in embrioni di topi adulti e 7. Questo metodo, tuttavia, non è attualmente molto utilizzato per esaminare l'organo di Corti dei mammiferi. Il potenziale di questa procedura per garantire sia la conservazione potenziata del citoarchitettura multa dell'organo del Corti adulti e consentire la quantificazione dei vari tipi di cellule è descritto.
Protocol
Discussion
La procedura di sezionamento vibratome, seguita da immagini immunoistochimica e confocale permette la visualizzazione delle dell'organo del Corti, con minimo danno tissutale. Chiaramente, le immagini confocale preso dalle regioni interne della sezione vibratome spettacolo eccellente conservazione della morfologia cellulare che è limitata solo dalla fissazione artefatti. Immagini confocale preso vicino alle due superfici di taglio di una sezione vibratome sono spesso indistinguibili dalle immagini provenienti dalle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'autore ringrazia vivamente l'uso di Ricerca dei Bambini Nucleo Istituto Imaging per la microscopia confocale e il dottor Zhang Jian per il suggerimento di montare sezioni utilizzando perline agarosio. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
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