Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA
Summary
Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di RNA<em> In vitro</em> Procedura SELEX. Un nuovo doppio inibitoria funzione anti-gp120 aptamer-siRNA chimera si crea e mostra la promessa considerevole sistemico terapia anti-HIV.
Abstract
L'epidemia globale di infezione da HIV ha creato un urgente bisogno di nuove classi di farmaci antiretrovirali. La capacità potente di small interfering (si) RNA di inibire l'espressione di trascrizioni di RNA complementare viene sfruttato come una nuova classe di terapie per una varietà di malattie tra cui l'HIV. Molti rapporti precedenti hanno dimostrato che nuove strategie a base di RNAi anti-HIV/AIDS terapeutiche sono molto promettente, ma uno dei principali ostacoli per l'applicazione di successo terapeutico e la traduzione clinica di siRNA è la consegna efficiente. In particolare, considerando la sicurezza e l'efficacia di terapie a base di RNAi, è altamente auspicabile per sviluppare un approccio mirato intracellulare consegna di siRNA a popolazioni di cellule o tessuti specifici. L'HIV-1 proteina gp120, una busta glicoproteina sulla superficie del virus HIV-1, svolge un ruolo importante in ingresso del virus nelle cellule CD4. L'interazione di gp120 e CD4 che innesca l'HIV-1 ingresso e avvia la fusione cellulare è stato convalidato come clinicamente rilevante anti-virale strategia di scoperta di nuovi farmaci.
Qui, abbiamo innanzitutto discutere la selezione e l'individuazione di 2'-F modificato anti-HIV gp120 aptameri RNA. Utilizzando un metodo convenzionale SELEX filtro di nitrocellulosa, diversi aptameri nuovo con affinità nanomolare sono stati isolati da un 50 casuale nt RNA biblioteca. Al fine di ottenere con successo le specie legate con maggiore affinità, il rigore selezione viene accuratamente controllato regolando le condizioni. Il aptameri selezionato può legano specificamente ed essere rapidamente internalizzato nelle cellule che esprimono la proteina di HIV-1 busta. Inoltre, il aptameri sola può neutralizzare l'infettività di HIV-1. Sulla base della miglior aptamer A-1, abbiamo anche creato un romanzo a doppia funzione inibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in cui sia il aptamer e le porzioni siRNA hanno potente attività anti-HIV. Inoltre, utilizziamo la gp120 aptamer-siRNA chimere per cellulari tipo di consegna specifiche del siRNA HIV-1 in cellule infette. Questa doppia funzione chimera indica un notevole potenziale per la combinazione di diversi agenti terapeutici degli acidi nucleici (aptamero e siRNA), nella soppressione da HIV-1, rendendo il aptamer-siRNA chimere attraente candidati terapeutici per i pazienti non aver terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART).
Protocol
Discussion
Aptameri sono evoluti in vitro degli acidi nucleici che assumono specifiche e stabili forme tridimensionali, fornendo in tal modo altamente specifico, legame stretto di molecole mirate 8. La bassa affinità nanomolare legame e specificità squisita aptameri ai loro obiettivi li rendono strumenti versatili per la diagnostica, imaging in vivo, e terapie 9. Con l'avvento della tecnologia per la consegna aptamer siRNA mirate è ora possibile utilizzare la funzione aptamer vincolan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Britta Hoehn, Guihua Sole, Harris Soifer e Lisa Scherer per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health AI29329 e HL07470 assegnato a JJR I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso la ricerca e l'AIDS NIH reagente Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: La CHO-EE e CHO-gp160 cellulare linea, il pNL4-3 luc vettoriale; HIV-1 BAL gp120 da DAIDS, NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
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