Summary
Vários aptâmeros 2'Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por RNA
Abstract
A epidemia global de infecção por HIV criou uma necessidade urgente de novas classes de agentes anti-retrovirais. A potente capacidade da pequena interferência (si) RNA para inibir a expressão de transcritos complementares RNA está sendo explorado como uma nova classe de tratamentos para uma variedade de doenças incluindo o HIV. Muitos relatórios anteriores mostraram que o romance baseado em RNAi anti-HIV/AIDS estratégias terapêuticas têm a promessa considerável, no entanto, um obstáculo chave para o êxito da aplicação terapêutica e tradução clínica de siRNAs é a entrega eficiente. Particularmente, considerando a segurança e eficácia de terapias baseadas em RNAi, é altamente desejável desenvolver uma abordagem de entrega prevista intracelular siRNA para populações de células ou tecidos específicos. O HIV-1 proteína gp120, uma glicoproteína do envelope na superfície do HIV-1, desempenha um papel importante na entrada do vírus nas células CD4. A interação de gp120 e CD4 que desencadeia HIV-1 de entrada e inicia a fusão celular foi validado como clinicamente relevante estratégia anti-viral para a descoberta de drogas.
Aqui, nós em primeiro lugar discutir a seleção e identificação de 2'-F modificado anti-HIV gp120 aptâmeros RNA. Utilizando um método convencional SELEX nitrocelulose filtro, várias aptâmeros novo com afinidade nanomolar foram isolados a partir de 50 nt RNA aleatórias biblioteca. A fim de conseguir obter espécies presos com maior afinidade, o rigor de seleção é cuidadosamente controlado, ajustando as condições. O aptâmeros selecionados podem se ligam especificamente e ser rapidamente internalizado nas células expressando a proteína do HIV-1 envelope. Além disso, o aptâmeros sozinho pode neutralizar o HIV-1 infectividade. Com base no melhor aptamer A-1, também criamos um romance dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera em que ambos os aptamer e as porções siRNA têm potentes atividades anti-HIV. Além disso, nós utilizamos a gp120 aptamer siRNA-quimeras para a célula do tipo de entrega específico do siRNA para HIV-1 células infectadas. Esta dupla função quimera mostra um potencial considerável para a combinação de vários agentes terapêuticos de ácido nucléico (aptamer e siRNA) na infecção por HIV-1 suprimindo, tornando-as quimeras aptamer siRNA atraente candidatos terapêuticos para pacientes com falha terapêutica anti-retroviral altamente ativa (HAART).
Protocol
1. Preparação da biblioteca de RNA
- A biblioteca de DNA a partir continha 50 nucleotídeos das seqüências aleatórias e foi sintetizada pelo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). O DNA de fita simples seqüência biblioteca oligo é 5'-GGG AGG ATG ACG CGG - N 50 - CAG CGC CCG ACG ACT A - 3 '(81 nt). A região aleatória é flanqueado por regiões constantes, que incluem o promotor T7 para transcrição in vitro e um 3 tag 'para RT-PCR. A 5 'e 3' seqüências constantes são 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) e 5 'TCG-GAG GGC TCG TCT G - 3' (16 mer), respectivamente. Faça solução estoque com água e armazenar em alíquotas a -20 ° C.
- Amplificar o DNA de fita simples oligo aleatórios da biblioteca (0,4 mM) por PCR usando 3 mM cada um de 5'-e 3'-primers, juntamente com 2 mM MgCl 2 e 200 mM de cada dNTP. A fim de preservar a abundância da biblioteca DNA original, limite de PCR a dez ciclos. Após as reações de PCR (10 reações, de 100 L por reação), recuperar a piscina dsDNA amplificados em um QIAquick Kit de purificação de Gel (QIAGEN).
- Converter o dsDNA resultante para uma biblioteca de RNA utilizando o Kit DuraScription (Epicentro, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Na mistura de reação de transcrição, substitua CTP e UTP com 2'-F-CTP e 2'-F-UTP para produzir RNA ribonuclease resistente. Tipicamente, preparar 20 mL de reação contendo 1 mg de DNA purificado template, 2 mL de buffer x 10, 2 mL dATP, dGTP 2 mL, 2 mL 2'-F-dCTP, 2 mL 2'-F-dUTP, 2 mL TDT e 2 mL T7 RNA polimerase em temperatura ambiente e, em seguida, incubar a 37 ° C por 6 h. (50 mM de cada dNTP).
- Posteriormente digerir a reação com DNase I (1,5 mL por 20 mL de reação de transcrição T7) para remover o DNA modelo e purificar por uma poliacrilamida 8% / 7 M uréia gel. Quantificar o RNA purified biblioteca por espectrofotometria de UV.
2. Geração in vitro de aptâmeros
- Antes da seleção, prepare o buffer de seleção e redobrando tampão. Prepare um tampão HEPES contendo 100 mM Hepes, pH 7.4. Use NaOH para ajustar o valor de pH e, em seguida, armazenar à temperatura ambiente. Prepare um buffer refolding RNA (5xHBS) contendo 50 mM Hepes pH 7,4, 750 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl 2; 13,5 mM KCl. Preparar um baixo teor de sal tampão RNA binding (10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, CaCl 2 1 mM, 1 mM MgCl 2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, 0,01% BSA e um alto-sal tampão RNA binding (10 HEPES mM pH 7,4, 150 mM NaCl, CaCl 2 1 mM, 1 mM MgCl 2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, BSA 0,01%). loja esses buffers a -20 ° C.
- Executar a SELEX principalmente como descrito 1-4. Antes de cada ronda de selecção, redobrar as piscinas RNA em 1xHBS tampão (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, CaCl 2 1 mM, 1 mM MgCl 2, 2,7 mM KCl), o calor a 95 ° C por 3 min e então lentamente legal a 37 ° C. Continue incubação a 37 ° C por 10 min.
- Geralmente, a fim de minimizar a ligação não específica com os filtros de nitrocelulose, pré-adsorver o refolded pools de RNA a um filtro de nitrocelulose (HAWP filtro, 0,45 mm) por 30 min, antes da incubação com o alvo do HIV-1 Bal proteína gp120.
- Incubar a pré-limpo piscina RNA com a proteína-alvo em baixa em sal buffer de RNA de ligação por 30 min para as rodadas SELEX 1-4. Após a quarta rodada de SELEX, use um alto-sal tampão RNA vinculativo. Com o progresso SELEX, reduzir a quantidade de proteína gp120 e aumentar o tRNA levedura concorrente a fim de aumentar o rigor das aptamer seleção.
- Para o primeiro ciclo de seleção, incube a pré-limpo piscina RNA aleatórias (40 mg, 1,5 nmol, 9x10 14 moléculas) e HIV-1 Bal proteína gp120 (0,23 nmol, RNA / Proteína relação de 6,5 / 1) em 200 mL de baixa sal tampão RNA vinculativo sobre uma plataforma giratória em temperatura ambiente por 30 min.
- Passe a reação através de um filtro de nitrocelulose pré-molhada e lave com um mL de tampão de ligação.
- Eluir o RNA vinculada do filtro com 200 mL tampão de eluição a 95 ° C por 5 min, seguida de extração fenol / clorofórmio e concentração com um YM-30 microcontrolador coluna. (7 M uréia e 5 mM EDTA)
- A transcrição reversa do RNA recuperado piscina usando o ThermoScript RT-PCR sistema (Invitrogen) e ampliar para 15 ciclos de PCR.
- Purificar a piscina dsDNA amplificados em um QIAquick Kit de purificação de Gel e transcrever como descrito acima para a próxima rodada de seleção.
3. Progresso SELEX monitorado por ensaio de ligação do filtro
- Monitorar o progresso SELEX do aptâmeros pelo ensaio de ligação do filtro. Trate a piscina com RNA CIP para remover o rótulo de iniciar 5'-trifosfato e depois com polinucleotídeo quinase T4 e γ-32P-ATP.
- Pmol de calor 10 de CIP tratados RNA biblioteca a 95 ° C por 5 min e depois relaxar no gelo. Posteriormente, adicionar 2mL de PNK buffer, 1 mL de polinucleotídeo quinase T4, 1 mL de ácido gama-P de 32 ATP e água a 20 mL.
- Incubar a 37 ° C por 30 min, em seguida, adicione 20 mu ^; L de água e purificar a reação por G-50 coluna. Finalmente, obter 40 mL de RNA rotulada a concentração final de 250 nM.
- Antes do ensaio, redobrar os rotulados piscinas RNA em 1xHBS tampão (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, CaCl 2 1 mM, 1 mM MgCl 2, 2,7 mM KCl), o calor a 95 ° C por 3 min e então lentamente legal 37 ° C. Continue incubação a 37 ° C por 10 min.
- Realizar uma mL 100 de reação de ligação como exemplo aqui. Incubar o fim marcado RNA piscina (10 nM) com proteína gp120 (100 nM) e um excesso de 10 vezes molar de inespecífica concorrente tRNA (100 nM) no buffer de RNA de alta-sal ligação por 30 min.
- Separar uma mL 50 de reação de ligação por um filtro de nitrocelulose pré-molhada.
- Lavar o filtro com 2 mL de tampão de ligação e contagem da radioatividade retida no filtro através de um contador de cintilação multi-propósito (Beckman Coulter). Como um controle de entrada, conte os restantes 50 mL da reação de ligação, ao mesmo tempo. Calcular a porcentagem do RNA retida no filtro na entrada de RNA como a afinidade de ligação.
4. Seqüenciamento de clonagem, e alinhamentos
- Após 11 rodadas, se não houver enriquecimento é observado mesmo após rondas de selecção adicionais em seguida, vinculando máxima da piscina RNA tem potencialmente sido atingido.
- A transcrição reversa do altamente enriquecido piscina aptamer (12 ª piscina RNA), utilizando o ThermoScript RT-PCR sistema (Invitrogen) e posteriormente ampliar o cDNA resultante da PCR. Purificar o produto de PCR usando um QIAquick Kit de purificação de Gel (QIAGEN). Clone do gel purificado o produto DNA no vetor de clonagem TA pCR 2.1 (Invitrogen). No total, inocular 170 clones individuais e ainda identificá-los por seqüenciamento de DNA para obter seqüências individuais.
- Classificar os clones individuais em seis grupos diferentes com base em alinhamentos de seqüências aptamer individual. Escolheu uma seqüência representante de cada grupo (A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 e B-68) para uma melhor caracterização por causa de sua abundância relativa dentro do seu grupo.
5. Geração de aptamer e RNAs quimera por transcrição in vitro
- Gerar diretamente double-stranded modelo de DNA por PCR usando 2 mM cada um de 5'-e 3'-primers, juntamente com 2 mM MgCl 2 e 200 mM de cada dNTP, e recuperar os produtos resultantes da PCR usando um Kit de purificação QIAquick Gel.
- Transcrever costa do sentido de sua quimera PCR modelos de DNA gerados usando o Kit DuraScription (Epicentro, Madison, WI). Na mistura de reação de transcrição, substituir o CTP canônica e UTP com 2'-F-CTP e 2'-F-UTP para produzir RNA que é resistente a RNase A degradação.
- Tipicamente, incubar 20 mL de reação contendo 1 mg de modelo de DNA, 2 mL 10xbuffer, 2 mL dATP, dGTP 2 mL, 2 mL 2'-F-dCTP, 2 mL 2'-F-dUTP, 2 TDT mL e 2 mL T7 RNA polimerase a 37 ° C por 6 h, e, posteriormente, purificá-la com colunas 30 Bio-Spin (Bio-Rad), após extração de fenol e precipitação de etanol.
- A fim de evitar resposta interferon, ainda tratar o RNA transcrito pela CIP para remover a iniciar 5'-trifosfato. Incubar mL 60 total de reação contendo 3 mg de transcrições, 6 mL de solução tampão 3 e 0,25 mL da CIP a 37 ° C por 60 min. Depois de fenol / clorofórmio e precipitação exação etanol, ressuspender RNA pellet em água.
- Para preparar as quimeras, combine as quimeras abrigar apenas o RNA fita senso com o RNA antisense apropriado em refolding calor buffer, a 95 ° C por 3 min e depois esfriar até 37 ° C lentamente. Continue incubação a 37 ° C por 10 min. Executar refolding passo de um buffer 1xHBS remate. Por exemplo: mix mL 10 de 10 mM vertente sentido quimera, 10 L de 10 strand antisense mM e 5 mL de buffer refolding (5xHBS) em 25 mL do sistema.
6. Determinação de constantes de dissociação por ensaios de gel shift
- final P 32 rotular o aptamer representante de cada grupo e fita senso quimeras e depois dobre RNA em tampão 1xHBS como descrito acima.
- Prepare 25 mL de gel de 5% através da mistura de 2,5 mL de tampão 10xTBE, com 3,125 mL de solução 40% de acrilamida / bis, 19,375 mL de água, 150 mL de persulfato de amônio 10% (APS) solução, e 30 Temed mL. O gel deve polimerizar em cerca de 30 min. Remova cuidadosamente o pente e usar uma seringa de 30 ml com agulha para lavar os poços com tampão de corrida (1xTBE).
- Completar a montagem da unidade de gel e se conectar a uma fonte de alimentação. O gel pode ser pré-run de uma hora a 180 V a 4 ° C.
- Serialmente diluir o HIV-1Bal proteína gp120 com tampão de ligação com as concentrações desejadas. O r finaisconcentrações eaction de gp120 são 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 nM. Incubar uma quantidade constante de 5'-P 32-end marcado RNA (10 nM), com aumento das concentrações de proteína gp120 no buffer de ligação (total de 20 mL de reação) em uma plataforma giratória em temperatura ambiente por 30 min.
- Após a incubação, misturar 20 mL de reação de ligação com 5 mL de tampão de carregamento nativas e de carga em um gel de poliacrilamida 5% não desnaturante. Preparar um tampão de carregamento nativa (4x) contendo 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% azul de bromofenol, 0,1% Xileno Cyanol FF, 0,1% Laranja G, glicerol 40%. Loja em alíquotas a -20 ° C.
- Eletroforese seguinte (180 V a 4 ° C por 2 horas, até que o corante secundário executa no meio do gel), expõe o gel a uma tela de imagem de fósforo e quantificar a radioatividade usando um scanner Typhoon.
- Calcular as constantes de dissociação utilizando regressão não-linear da curva com um Pad Prism Gráfico.
7. Superfície celular Estudos de ligação por citometria de fluxo
- Gerar aptamer fluorescentes e quimeras usando o Silencer Kit Labeling siRNA (Ambion). Adicionar os reagentes na seguinte ordem: 22,5 de água livre de nuclease mL, 5 mL 10 x Tampão Rotulagem; 15 RNA mL (5 mg); 7,5 mL Dye Labeling. Incubar total de 50 mL de reação rotulagem a 37 ° C por 1 hora.
- Após a incubação, adicionar 5,0 mL (0,1 vol) 5 M NaCl e 125 mL (2,5 vol) EtOH 100% frio, e misture bem. Incubar a -20 ° C por 60 min. Centrifugar a velocidade máxima a 4 ° C por 20 min. Remover o sobrenadante e lavar pellet com 175 mL EtOH 70%. Ar seco pellet no escuro e depois suspender RNA marcados em 15 mL de água livre de nuclease.
- Medir a absorvância da RNA rotulados a 260 nm e no máximo de absorção para o corante fluorescente. Calcular a base de: razão de corante e concentração de RNA de acordo com a calculadora fornecida pelo http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html .
- Mix Cy3 marcado com fita senso quimeras e antisense fio e dobre em refolding buffer como descrito acima.
- Obter CHO-WT expressando gp160 e células CHO-EE controle através do Programa de Investigação sobre SIDA e de reagente de referência 5, 6. Cultivar células em GMEM-S médio (Glutamina com deficiência de meio mínimo essencial com 400 mM sulfoximina metionina (MSX)) (Gibco, Invitrogen). Cultura as células em um umidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Lavar a gp160 CHO-WT ou células CHO-EE controle com tampão de lavagem pré-aquecida, trypsinize e retire das placas. Após a lavagem as células duas vezes com 500 mL de buffer de ligação, resupend as pelotas de células em tampão de ligação e incubar a 37 ° C por 30 min. Células da pelota e, em seguida, ressuspender-los em 50 mL de tampão de ligação pré-aquecida, contendo 400 nM Cy3 marcado RNAs experimental.
- Após a incubação a 37 ° C por 40 min, lave as células três vezes com 500 mL de tampão de ligação pré-aquecida, e, finalmente, ressuspender em 350 mL de tampão de ligação pré-aquecido a 37 ° C e imediatamente analisar por citometria de fluxo.
8. Internalização e estudos de localização intracelular por Live-célula microscopia confocal
- Antes de um dia de ensaio, crescem a gp160 CHO-WT e células CHO-EE controle de placa em 35 mm, com semeadura em 0.3x10 6 em 2 médio GMEM-S mL para permitir a confluência cerca de 70% em 24 h.
- No dia dos experimentos, lavar as células com 1 mL de PBS pré-aquecido. E incubar com 1 mL de pré-aquecido médio de crescimento completo por 30 min a 37 ° C.
- Prepare Cy3 marcado aptamer siRNA-quimeras, como descrito acima. Incubar a redobrar aptamer-pau com o pau siRNA contendo 5'-Cy3 marcado com fita senso para formar o conjugado aptamer-stick siRNA, conforme descrito acima.
- Antes do ensaio, prepare 0,15 mg / mL de Hoechst 33342 (corante nuclear de células vivas, Molecular Probes, Invitrogen, CA) em água e armazenar em alíquotas a 4 ° C.
- Mancha as células por tratamento com 0,15 mg / mL Hoechst 33342 por 15 min a 37 ° C. Imediatamente, lavar a tinta com 1,0 ml de meio fresco duas vezes e substituir 2 mL pré-aquecido meio fresco.
- Adicione o Cy3 marcado aptamer siRNA-quimera em uma concentração de 100 nM final para a mídia e incubar em células vivas, microscopia confocal em 5% CO2 microscopia incubadora a 37 ° C.
- Recolher as imagens a cada 15 minutos usando um Zeiss LSM 510 Meta invertido dois fótons sistema de microscópio confocal sob imersão em água a ampliação de 40x.
9. In vitro desafio HIV-1 e dosagem do antígeno p24
- Compra CCRF-CEM células do ATCC. Crescer em RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech Inc.) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS, HyClone), L-glutamina e 1xPen-Strep (Gibco, Invitrogen). Células de cultura em um umidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Obter mononucle sangue periféricoamostras de ar a partir de dadores saudáveis, da City of Hope National Medical Center (da equipe da clínica).
- Isolar PBMCs do sangue total por centrifugação através de solução de Ficoll-Hypaque (Histopaque-1077, Sigma). Destroem as células CD8 (células T-cytotoxic/suppressor) de PBMCs usando Dynabeads CD8 (Invitrogen, CA).
- Cultivar células em células T meio ativo (BioE, St. Paul, MN). Células de cultura em um umidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C.
- Obtenção de HIV-1 IIIB e NL4-3 do vírus HIV-1 e vírus Bal da Pesquisa AIDS e do Programa de reagente de referência. Depois de propagação do vírus da loja, em alíquotas a -80 ° C.
- Infectar CCRF-CEM células ou PBMCs humano com vírus HIV (IIIB, NL4-3 ou Bal) (MOI 0,001 ou 0,005). Após 24 horas de pós-infecção, lavar cuidadosamente as células com PBS três vezes para remover o vírus livre. Continue com a cultura, as células infectadas em um 5% CO 2 microscopia incubadora a 37 ° C por 4 dias.
- Antes de RNA tratamentos, lavar cuidadosamente as células infectadas com PBS três vezes para remover o vírus livre. Incubar 2x10 4 células infectadas e 3x10 4 células não infectadas com redobrada RNAs experimental a 400 nM concentração final em placas de 96 poços a 37 ° C (100 mL por poço, ensaio triplex).
- Recolher o sobrenadante da cultura (10 mL por poço) em diferentes épocas (3 d, 5 d, 7 e 9 d d) e armazenar a -20 ° C até serem analisadas p24.
- Realizar as análises do antígeno p24 utilizando um antígeno HIV-1 p24 ELISA kit.
10. A detecção função siRNA por ensaio quantitativo RT-PCR
- Infectar CCRF-CEM células ou PBMCs humano com HIV vírus (IIIB, NL4-3 ou Bal) e tratar com o RNAs experimental (400 nm), como descrito acima.
- Após 7 dias de tratamento, as células da pelota e isolar RNAs total com STAT-60. Tratar os RNAs totais com DNase I para remover DNA genômico e produzir cDNA utilizando 2 mg de RNA total.
- Misture os seguintes reagentes: 8 mL de água livre de nuclease, 1,5 mL 10 x DNase tampão, 4 RNA mL (2 mg), 0,5 mL inibidor RNain e 1,0 mL RNase DNase I. Incubar 15 mL de reação total 37 ° C para 1 horas e calor de 80 ° C por 10 min para a inativação DNase I. Imediatamente, chill a reação sobre o gelo.
- Adicione 2 mL de primer aleatório (50 ng / mL) e 1μL de dNTP (10 mM) na mistura de reação acima, e então o calor de 65 ° C por 5 min. Imediatamente, chill a reação sobre o gelo.
- Adicionar os seguintes reagentes: 5 mL 5xFirst strand buffer; 2,5 mL 0,1 M DTT, 0,5 mL RNain inibidor e 1,0 mL MMLV-RT. Incubar a reação total 27 mL a 25 ° C por 10 min e 37 ° C por 1 hora. Após reação da mistura de calor, a 70 ° C por 15 min para a inativação da transcriptase reversa e depois relaxar no gelo. O cDNA está pronto para qRT-PCR.
- Analisar a expressão dos genes alvo por RT-PCR quantitativo utilizando 2 x iQ SyberGreen Mastermix e conjuntos de primer específico na concentração final de 400 nM (ensaio triplex). Use a expressão GAPDH como controle interno para a normalização dos dados qPCR.
11. Resultados representativos:
1. Aptâmeros nova RNA contra o HIV-1 gp120 BaL são isoladas e caracterizadas.
Conforme descrito na seção experimental, uma biblioteca de oligonucleotídeos inicial DNA contendo uma região 50 nt aleatória ladeado por regiões primário fixada na 5 'e 3' termina é amplificada e transcrita em uma piscina RNA. Esta biblioteca inicial consiste em até 10 15 seqüências diversas (1 nmol), que dobra em uma vasta gama de diferentes estruturas 3-D. A alta complexidade e diversidade da biblioteca inicial pode garantir a presença de estruturas de ativos com afinidade de ligação bom para o alvo.
Empregar um procedimento in vitro SELEX (Figura 1) para selecionar 2'-fluoropirimidina aptâmeros modificada RNA que se ligam seletivamente a R5 estirpe HIV-1 BaL proteína gp120 do envelope 7. Conforme mostrado na Figura 1, uma estratégia de seleção de nitrocelulose com base é feita para isolar-alvo específicos de ligação a partir de moléculas de RNA não-vinculativo RNA. Uma vez que a proteína adere a nitrocelulose, apenas o RNA / proteína complexos ou agregados podem ser retidos na membrana e RNAs livres são lavadas. Em condições de desnaturação, a RNAs ligados são recuperados e são reverso transcrito para cDNA e amplificado para dsDNA e, posteriormente, transcritos in vitro para criar um pool de RNA novo ciclo de seleção seguinte. O rigor de seleção é aumentada, reduzindo a quantidade de proteína-alvo e aumentar a quantidade de tRNA concorrente. A quantidade de RNA piscina, proteínas e tRNA concorrente utilizados em cada fase de selecção é mostrada na Tabela 1.
Monitorar o progresso da seleção após cada ciclo SELEX pelo ensaio filtro de ligação. Avaliar a afinidade de ligação como a porcentagem do RNA retida no filter na piscina RNA total. A partida piscina RNA (1-RNA) mostra apenas 0,1% dos RNAs de entrada retidos na membrana. No entanto, depois de nove rodadas de seleção a nona biblioteca de RNA (9-RNA) tem 9,72% da entrada de RNA ligado. Apesar de rondas de selecção adicionais foram realizadas, sem enriquecimento é observado, sugerindo que a ligação máxima da piscina RNA foi alcançado (Figura 2A). Semelhante com o ensaio do filtro de ligação, o ensaio de gel shift também é uma das estratégias mais populares para determinar constantes de dissociação. Este procedimento é fácil e conveniente. Conforme mostrado na Figura 2B, ensaios de gel shift confirmar ainda mais as atividades de ligação das piscinas RNA. Estes resultados demonstram que alguns ligantes com alta especificidade de ligação para a proteína-alvo são sucessivamente enriquecida nestas piscinas RNA ..
Clonar e seqüenciar o aptamer piscinas altamente enriquecido (12-RNA). De acordo com os alinhamentos de seqüências individuais aptamer clonados, seis diferentes grupos são classificados como mostrado na Tabela 2. Cerca de 40% dos clones (Grupo I e II aptâmeros) contém uma seqüência conservada: Um TTGAGGGACC (A / G) (A / G). Nós escolhemos uma seqüência representante de cada grupo (por exemplo: A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 e B-68) para uma melhor caracterização por causa de sua abundância relativa dentro do seu grupo. Através de um nativo ensaio de gel shift mobilidade, as constantes de dissociação (K d) destes aptâmeros representante são calculados (Figura 3A). Por exemplo, A-1, o melhor do aptâmeros, tem um aparente Kd os valores de 52 nM (Figura 3B). Conforme mostrado na Figura 3A, estes aptâmeros selecionados podem se ligam seletivamente com a meta de HIV-1 Bal gp120, mas não o HIV proteína gp120 CM.
2. Anti-gp120 se liga especificamente aptamer e é internalizado pelas células expressando HIV gp160 e inibir a infecção VIH-1 em cultura de células.
CHO-gp160 células estavelmente expressando o HIV gp160 glicoproteína do envelope são usados para testar para a internalização de ligação e do anti-gp120 selecionados aptâmeros. Estas células não processam em gp160 gp120 e gp41, uma vez que falta a mordaça proteases codificadas necessários para envelope de processamento. Como controle utilizamos a linhagem de células CHO-EE dos pais que não expressa gp160. Análises de citometria de fluxo (Figura 4A) revelam que o Cy3 marcado aptâmeros ligam especificamente para as células CHO-gp160, mas não controlar o CHO-EE células. Além disso, em tempo real, em células vivas, microscopia confocal eixo Z indica que o Cy3 marcado aptamer é seletivamente internalizados no CHO-gp160 células (Figura 4B e 4C) após 2 horas de incubação, mas não as células CHO-EE controle ( Figura 4D 4C). Figura também mostra que o aptamer agregados dentro do citoplasma, o que sugere a gp120 aptâmeros talvez entrar nas células através de endocitose mediada pelo receptor.
No ensaio HIV-1 desafio, HIV-1 infectados PBMC-células são tratadas com o aptâmeros. Em dias diferentes pós-tratamento com o aptâmeros, alíquotas dos meios de comunicação são analisadas para níveis de antígeno viral p24 (Figura 4E). Os resultados mostram que o anti-gp120 aptâmeros (A-1) inibe a produção de HIV-1 p24 com uma concentração nano-Molar.
3. Anti-gp120 aptamer siRNA-quimera é projetado e avaliado sua eficácia como tipo celular específico sistema de entrega de siRNA
Conforme mostrado na Figura 5A, o aptamer e segmento sentido vertente do siRNAs contidas nuclease resistente 2'Fluoro-UTP e 2'Fluoro-CTP e são sintetizados a partir de modelos dsDNA correspondente transcrição in vitro bacteriófago. A fim de aumentar a flexibilidade da molécula, um linker dois nucleotídeos (UU) é inserido entre a aptamer ea porção substrato Dicer. Para preparar o siRNA contendo quimeras, in vitro transcritos quiméricos polímeros aptamer senso vertente são recozidos com concentrações equimolares de uma RNA fita antisense inalterado. Estes dados do ensaio de gel shift (Figura 5B) e citometria de fluxo (Figura 5C) indicam que as quimeras manter aproximadamente as mesmas afinidades de ligação como a aptâmeros sozinho. As imagens do tempo-curso de real-time microscopia confocal (Figura 5D) mostram que Cy3 marcado quimera Ch A-1 pode ser internalizado com sucesso para o citoplasma de células. Como esperado, nenhuma captação da quimera é observado com as células CHO-EE controle (Figura 5E).
Da mesma forma, o potencial antiviral de RNAs é avaliada pelo HIV-1 ensaio de desafio. Os resultados das análises do antígeno HIV p24 (Figura 6A e 6B) mostram que tanto aptamer quimera e inibir a produção de p24, mas o mais forte inibição é observada com o Ch quimera A-1 do tratamento.
Para confirmar que o componente siRNA está funcionando junto com a APTAmer, na sequência de internalização do Ch A-1 quimera em células infectadas, nós também avaliar os níveis relativos de inibição da tat / rev expressão gênica por ensaios de RT-PCR quantitativa expressão. Nós achamos que o tratamento de células infectadas com as quimeras é capaz de induzir o silenciamento do gene tat / rev, enquanto o aptamer por si só não afetou tat / rev expressão gênica (Figura 6C e 6D). Estes resultados fornecem apoio adicional de que o siRNA aptamer entregues triggers RNAi.
| A quantidade de proteínas, RNA piscina e tRNA usados para a seleção | |||||
| Rounds SELEX | Proporção de Alvo / RNA | Proteína gp120 | RNA piscina | TRNA concorrente | Tampão de seleção |
| 1 | 1/6.5 | 229,8 pmol | 1,5 nmol (40,1 mg) | 0 | Tampão SELEX pouco sal |
| 2 | 1/6.5 | 114,9 pmol | 0,75 nmol (20,1 mg) | 0,25 nmol (6,6 mg) | |
| 3 | 08/01 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 mg) | 0,25 nmol (6,6 mg) | |
| 4 | 08/01 | 76,6 pmol | 0,625 nmol (16,7 mg) | 0,25 nmol (6,6 mg) | |
| 5 | 08/01 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 mg) | 0,5 nmol (13,2 mg) | Tampão SELEX alta de sal |
| 6 | 08/01 | 38,3 pmol | 0,306 nmol (8,18 mg) | 0,5 nmol (13,2 mg) | |
| 7 | 10/01 | 26,8 pmol | 0,268 nmol (7,16 mg) | 0,5 nmol (13,2 mg) | |
| 8 | 10/01 | 26,8 pmol | pmol 0,268 nmol (7,16 mg) | 1 nmol (26,4 mg) | |
| 9 | 10/01 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 mg) | 1 nmol (26,4 mg) | |
| 10 | 10/01 | 15,3 pmol | 0,153 nmol (4,09 mg) | 1,5 nmol (39,6 mg) | |
| 11 | 1/12.5 | 7,66 pmol | 0,096 nmol (2,56 mg) | 2 nmol (52,8 mg) | |
| 12 | 1/12.5 | 7,66 pmol | 0,096 nmol (2,56 mg) | 2 nmol (52,8 mg) | |
Tabela 1. As condições de seleção. A quantidade de proteínas, RNA piscina e tRNA usado para cada seleção e buffer são indicados.
| Grupo | RNA | Seqüências aleatórias | Freqüência (140 clones) |
| Grupo I | A-1 | AATTGAGGGACCA CGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAG TTTGT CG GATGG | 33 (23,6%) |
| B-7 | AATTGAGGGACCA ACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTA TTTGC GT GATGG | 3 | |
| A-32 | AATTGAGGGACCG TTGGTAAAAGCCGGA AATTG AGCT TTTAC GGC GATGG | 5 | |
| B-55 | AATTGAGGTACCGCG TTATTAGGAACA AATTG GAATTCTAAACGC GATGG | 2 | |
| A-24 | AATAGAGGGACC CAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTG GATGG | 1 | |
| B-19 | AATAGAGGAACCG TTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGC GACGG | 1 | |
| B-31 | AATAGAGGGACCG TGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCAC GATGG | 1 | |
| Grupo II | A-12 | AGTAGAGGAACCA AGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTT GATGG | 10 (7,1%) |
| Grupo III | A-9 | TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG | 15 (10,7%) |
| Grupo IV | A-28 | TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACG TTTGTG | 10 (7,1%) |
| Grupo V | A-5 | GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCG TTGGTG | 9 (6,4%) |
| Grupo VI | B-68 | ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT | 2 |
| Outros | Seqüência órfão | 48 |
Tabela 2. O alinhamento e identificação de aptâmeros RNA. Após a 12 ª rodada da seleção, a piscina RNA selecionada foi clonado e sequenciado. Após o alinhamento de todos os 140 clones, seis grupos de anti-gp120 aptâmeros foram identificados. Apenas as seqüências aleatórias das regiões aptamer núcleo (5'-3 ') são indicados. Isola ocorrendo com múltiplas freqüências são especificados.
Figura 1: Representação esquemática do processo de selecção in vitro utilizando uma membrana de nitrocelulose, para a geração de aptâmeros de RNA do HIV-1 Bal proteína gp120. (A) A partida piscina RNA e proteínas-alvo foram incubados para formar complexos. (B) As moléculas de RNA ligado foram retidos na membrana e eluída da membrana sob condição de desnaturação. (C) Os RNAs não ligado foram lavados. (D) Os RNAs selecionadas foram transcritas e reverter amplificado por PCR. (E) O DNA relevante foi posteriormente transcrita em RNA piscina nova de ciclos de seleção seguinte. (F) Após 15/10 rondas de selecção, os aptâmeros selecionados foram clonados e seqüência.
Figura 2: A evolução do HIV-1 de seleção aptâmeros gp120. (A) A actividade de ligação da piscina RNA em cada ciclo foi analisada pelo ensaio de ligação com filtro tRNA concorrente. Atividades de ligação foram calculadas como a percentagem do consumo de RNA retidas no filtro de proteína / RNA complexa. (B) A actividade de ligação da piscina RNA em cada ciclo foi analisado por ensaio de gel shift. A 12 ª piscina RNA mostraram a maior atividade de ligação.
Figura 3: ensaio de atividade de vinculação dos selecionados aptâmeros individuais contra o HIV-1 Bal gp120. (A) A 5'-end P 32 rotulado aptâmeros individuais foram incubadas com as quantidades crescentes de proteína gp120-alvo ou não-específicas da proteína CM. As misturas reação de ligação foram analisados por um ensaio de gel shift mobilidade. Aptamer A-1 e B-68 mostrou a melhor afinidade de ligação com a proteína-alvo, mas a proteína não CM. Dados representam a média de quatro repetições. (B) curva de ligação de um ensaio de gel shift.
Figura 4: Célula tipo de ligação específicos e estudos de absorção de aptâmeros. (A) de ligação de superfície celular de Cy3 marcado RNAs foi avaliada por citometria de fluxo. RNAs Cy3-rotulados foram testados para a ligação com CHO-gp160 e células CHO-EE controle. O aptâmeros selecionados mostraram células tipo de afinidade de ligação específico. O 2 º RNAs RNA piscina e irrelevantes foram utilizados como controle negativo. Dados representam a média de três repetições. (B) análise de Internalização. CHO-gp160 células foram cultivadas em placas de 35 mm e incubados com uma concentração de 100 nM Cy3 marcado A-1 em meio de cultura para análise em tempo real microscopia em células vivas-confocal. As imagens foram coletadas em 15 min. intervalos usando aumento de 40 vezes. (C, D) análise de localização. CHO-gp160 e células CHO-EE controle foram cultivadas em placas de 35 mm. Antes da incubação com 100 nM de Cy3 marcado A-1, as células foram coradas com Hoechst 33342 (corante nuclear de células vivas) e, em seguida, analisados em tempo real usando microscopia confocal. (E) Os selecionados anti-gp120 aptâmeros inibir a replicação do HIV-1 em PBMCs humano previamente infectadas com HIV-1 NL4-3 vírus. Diferentes concentrações e tempo de pointes foram apresentados. IC50 valor foi listado. Dados representam a média das medições triplicado de p24.
Figura 5: A concepção e avaliação do sistema de entrega aptamer siRNA-quimera. (A) Esquema aptamer siRNA-RNAs quiméricos: a região do aptamer anti-gp120 é responsável pela ligação a gp120 ea siRNA está concentrada em um exon comum do HIV-1 tat / rev. Sentido, a vertente 2'Fluoro-modificado aptamer siRNA-single foi co-transcritos, seguida de recozimento da cadeia complementar siRNA antisense para completar a molécula quimérica. A linker (UU) entre o siRNA aptamer e está indicada em verde. (B) O RNAs aptamer siRNA-quiméricos que têm valores comparáveis Kd, bem como aptâmeros pais ligam especificamente o HIV Bal proteína gp120. Dados representam a média de três repetições. (C) Célula tipo específico de estudos de ligação de aptâmeros. RNAs Cy3-rotulados foram testados para a ligação com CHO-gp160 e células CHO-EE controle. Célula surbindings face de Cy3 marcado RNAs foram avaliadas por citometria de fluxo. O aptâmeros selecionados mostraram células tipo de afinidade de ligação específico. O 2 º RNA piscina e RNA irrelevantes foram utilizados como controle negativo. Dados representam a média de duas repetições. (D, E) Internalização e análises de localização intracelular. CHO-gp160 células foram cultivadas em placas de 35 mm e foram corados com Hoechst 33342 (corante nuclear de células vivas). Posteriormente, as células foram incubadas em meio de cultura com uma concentração de 100 nM de Cy3 marcado quimera para análise em tempo real de microscopia confocal em células vivas, como descrito anteriormente.
Figura 6: inibição dupla da infecção HIV-1 mediada por aptamer siRNA-quimeras. Ambos aptamer anti-gp120 e aptamer siRNA-quimeras neutralizado infecção VIH-1 nas células (A) CEM (cepa IIIB) e (B) cultura PBMCs humano (cepa LBA), respectivamente. Dados representam a média das medições triplicado de p24. As quimeras mostrou mais forte do que a inibição aptamer sozinho indicando que (C, D) siRNA o proferido pelo aptâmeros down-regulado a expressão do gene tat / rev em PBMCs. Dados representam a média de três repetições.
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Discussion
Aptâmeros são in vitro evoluiu ácidos nucléicos que assumem específica e estável formas tridimensionais, proporcionando assim altamente específico, forte ligação às moléculas alvo 8. A afinidade nanomolar baixa ligação e especificidade requintado de aptâmeros a seus alvos torná-los ferramentas versáteis para diagnóstico, in vivo de imagem e terapêutica 9. Com o advento da tecnologia aptamer para entrega siRNA alvo agora é possível usar a função de ligação para aptamer endocitose mediada pelo receptor de siRNAs 10-12. Aptâmeros levantadas contra receptores de membrana emergiram como veículos de entrega promissores para atingir uma doença distinta ou tecido de uma maneira celular tipo específico 13, que pode melhorar a eficácia terapêutica, bem como reduzir os indesejáveis efeitos colaterais tóxicos de drogas.
Até agora, um número crescente de aptâmeros que visam um tipo específico de célula ou subpopulação de células malignas têm sido isoladas e caracterizadas com sucesso, quer através de membrana tradicionais à base de proteínas purificadas SELEX ou intacta processos baseados em células SELEX. Geração eficiente de aptâmeros novas células específicas agentes homing ainda representa um desafio-chave ao realizar seleção com proteínas recombinantes devido à indisponibilidade das espécies receptor desejado, lábil nativas e problemáticas propriedades bioquímicas ou físicas. Portanto, baseada em células SELEX fornece uma alternativa para a geração de aptâmeros que pode se ligam especificamente a uma determinada população-alvo celular. No entanto, observou-se que as células mortas sempre incorrer ligação não específica de ácidos nucléicos, causando-Cell SELEX fracasso. Além disso, em contraste com o tradicional purificada SELEX à base de proteínas, a complexidade e diversidade das células da superfície também aumentam as dificuldades para Cell-SELEX procedimento. Até agora, a maioria dos aptâmeros células específicas para entrega direcionados evoluíram usando a proteína purificada método baseado SELEX.
Entre essas estratégias convencionais para o isolamento de aptâmeros, a membrana de nitrocelulose com base-SELEX está bem estabelecido e documentado em numerosas publicações. Aqui, nós utilizamos este procedimento para isolar com sucesso vários novos anti-HIV gp120 aptâmeros RNA, que são capazes de se ligam especificamente gp120 e são internalizadas em células que expressam o envelope HIV. Como uma das vantagens desta técnica, não é necessário modificar as moléculas-alvo (por exemplo: proteína) e imobilizar o alvo em uma fase sólida adsorvente (tais como: contas, coluna de resina, placa ou chip), que doesn 't afetam confirmação originais do alvo. É mais confiável e direta para a seleção. A fim de enriquecer as espécies ligado RNA com maior afinidade, o rigor de seleção é cuidadosamente controlado, ajustando as condições, como o sistema de buffer de seleção, a concentração de proteína-alvo, tRNA concorrente e os tempos de lavagem 8. Durante a seleção, a afinidade de ligação é monitorado para fazer o enriquecimento a certeza e progresso de seleção, assim afinar a condição para a ronda de selecção seguinte. Estes aptâmeros pode inibir várias diferentes cepas do HIV-1, indicando que aptâmeros anti-gp120 que inibem o passo inicial do HIV-1 entrada, bloqueando a ligação da gp120 e receptores CD4 pode ser útil em HIV-1 aplicações terapêuticas. Nós também capitalizar sobre a especificidade de um requintado aptamer gp120 para entregar anti-HIV siRNAs em células infectadas pelo HIV com o resultado líquido que a replicação e disseminação do HIV é fortemente inibida pela ação combinada da aptamer e uma siRNA visando o tat / rev exon comum do HIV-1 7, 14. Portanto, o anti-gp120 aptâmeros pode funcionar tanto como agentes antivirais e como reagentes de entrega siRNA.
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Disclosures
J. R e JZ tem uma patente pendente em "sistema de entrega de celular tipo específico aptamer siRNA para HIV-1 terapia". USPTO, No.
Acknowledgments
Agradecemos a Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer e Lisa Scherer para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e AI29329 HL07470 concedido a JJR Os seguintes reagentes foram obtidos através da AIDS NIH Programa de Pesquisa e de reagente de referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH: O CHO-EE e CHO-gp160 celular linha, a pNL4-3 luc vetor; HIV-1 BaL gp120 de DAIDS, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MF-Millipore membrane filter | EMD Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | EMD Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | EMD Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | Epicentre Biotechnologies | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche Group | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | National Institutes of Health | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Glycogen | Roche Group | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedicals | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10') | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100') | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
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