Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Summary

Quantificar os níveis de HIV-1 RNA no plasma e seqüenciamento única HIV-1 genomas de indivíduos com carga viral abaixo do limite de detecção (50-75 cópias / ml) é difícil. Aqui nós descrevemos como extrair e quantificar RNA viral no plasma usando um ensaio de PCR em tempo real, que de forma confiável medidas HIV-1 RNA até 0,3 cópias / ml e como amplificar genomas virais por seqüenciamento do genoma único, a partir de amostras com cargas virais muito baixas.

Abstract

Amplificar genes virais e quantificar HIV-1 RNA do HIV-1 indivíduos infectados com cargas virais abaixo do limite de detecção por ensaios padrão (abaixo de 50-75 cópias / ml) é necessário ter uma visão para a dinâmica viral e interações hospedeiro do vírus em pacientes que naturalmente controlar a infecção e aqueles que estão em terapia anti-retroviral combinada (TARC).

Aqui nós descrevemos como para amplificar genomas virais por uma única seqüenciamento do genoma (o protocolo SGS) ^{13, 19} e como quantificar com precisão HIV-1 RNA em pacientes com baixa carga viral (a cópia de um único ensaio (SCA) protocolo) ^{12, 20.}

O ensaio de um único exemplar é um real-time PCR com sensibilidade, dependendo do volume de plasma sendo ensaiadas. Se um genoma único vírus é detectado em 7 ml de plasma, então o número de cópias de RNA é de 0,3 cópias / ml. O ensaio tem um teste de controlo interno para a eficiência de extração de RNA, e controles para a amplificação de DNA ou possível contaminação. Amostras de pacientes são medidos em triplicata.

O seqüenciamento do genoma de um único ensaio (SGS), hoje amplamente utilizado e considerado como não-trabalho intensivo ^{3, 7, 12, 14, 15,} é um ensaio por diluição limitante, em qual ponto de extremidade produto diluído cDNA é espalhada sobre uma de 96 poços prato. De acordo com uma distribuição de Poisson, quando menos de 1 / 3 dos poços dão produto, há uma chance de 80% resultante do produto de PCR de amplificação sendo a partir de uma única molécula de cDNA. SGS tem a vantagem sobre a clonagem de não ser submetido a reamostragem e não ser influenciada por PCR-introduzido recombinação ^19. No entanto, o sucesso de amplificação da SCA e SGS dependem desenho de primers. Ambos os ensaios foram desenvolvidos para HIV-1 subtipo B, mas pode ser adaptado para outros subtipos e em outras regiões do genoma de primers mudando, sondas, e padrões.

Protocol

1. Extração de RNA a partir de grandes volumes de plasma Uma visão geral do ensaio de cópia única (SCA) eo único seqüenciamento do genoma (SGS) protocolo são fornecidos nas Figuras 1 e 2. Para obter 7 ml de plasma, spin aproximadamente 14 ml de sangue foram coletadas em 15 ml de EDTA (não heparina) tubos de coleta a 2.600 xg por 15 minutos sem travões. Pipeta plasma (certificando-se de evitar a camada de revestimento buffy) em tubos de 15 ml. Se RNA está sendo…

Discussion

HIV-1 indivíduos infectados em tratamento antiretroviral combinada (TARC) ou que naturalmente controlar a infecção têm cargas virais muito baixas, normalmente cerca de 1 cópia por ml de plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Carga viral em pacientes com controle natural, muitas vezes oscilam em torno de um conjunto individual ponto ^{1, 2, 17.} A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é altamente dependente do volume de entrada de plasma. Geralmente, temos vindo a trabalhar com 7 ml de plasma, mas os resul…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Random hexamers (500 ug/ml)	Promega	C118A
Taqman buffer A	Applied Biosystems	4304441
RNAsin (40 U/ul)	Promega	N211B
RT enzyme (200 U/ul)	Strategene	600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase	Applied Biosystems	4311814	6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X buffer	Invitrogen		comes with the enzyme
DTT 100 mM	Invitrogen		comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul	Invitrogen	11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer	Invitrogen	11304-102	comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml	Ambion	2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M	FlukaBiochemica	50983
Glycogen 20 mg/ml	Roche	10901393001
Isopropanol	Sigma-Aldrich	19516
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich	E702-3
Molecular grade water	Gibco/Invitrogen	10977-015
dNTPs (25 mmol each)	Bioline	BIO-39025

Name of Euipment	Company	Catalogue number	Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm)	Seaton Scientific	6041
White Delrin crowns	Seaton Scientific	4020	Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml	Beckman	361642
Hex driver ½ inc opening	Seaton Scientific	4013
cap removal tupe	Seaton Scientific	4014
5 ml serological pipettes	Costar	4051
Pipetboy	any
15 ml Transfer pipettes	ISC Bioexpress	P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip	VWR	14670-329
15 ml centrifuge tubes	Falcon
1 ml centrifuge tubes	any
Tris buffer Saline tablets	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor	Sorval	90SE and T-1270
96-well PCR plates	Biorad	HSS-9601
50 ml Reagent reservoir	Costar	4870
Microamp optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems	N801-0560
Optical plate covers	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp Optical Compression Pad	Applied Biosystems	4312639
Microseal A film	Biorad	MSA-5001
2 ml centrifuge tubes	Any
1% agarose gels (E-gel, invitrogen)	Invitrogen	G-7008-01
E-base (Invitrogen)	Invitrogen	EB-M03

EDTA Collection tubes any brand