Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo's
Summary
Een verscheidenheid van groeifactoren en eiwitten interageren te bewegen cellen op zich te nemen andere cel lot tijdens de ontwikkeling. Hier laten we zien het gebruik van een in-ovo voorbereiding op mogelijke interacties tussen verschillende eiwitten in de ontwikkeling te pakken door het plaatsen van kralen op E2.5 kippenembryo's.
Abstract
De neurale buis drukt vele eiwitten in specifieke tijdruimtelijke patronen tijdens de ontwikkeling. Deze eiwitten is aangetoond dat ze kritisch zijn voor lot van de cel bepalen, celmigratie, en de vorming van neurale circuits. Neuronale inductie en patroonvorming te betrekken botmorfogenetische eiwit (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast groeifactor (FGF), onder anderen. In het bijzonder, het expressiepatroon van Fgf8 is in de nabijheid van de regio's uiten BMP4 en SHH. Deze uitdrukking patroon is in overeenstemming met ontwikkelingsstoornissen interacties die patronen te vergemakkelijken in de telencephalon.
Hier bieden wij een visuele demonstratie van een methode waarbij een in-ovo preparaat kan worden gebruikt om de effecten van fgfs in de vorming van de voorhersenen test. Kralen worden gecoat met eiwit en geplaatst in de zich ontwikkelende neurale buis om langdurige blootstelling te bieden. Omdat de procedure maakt gebruik van kleine, zorgvuldig geplaatste kralen, het is minimaal invasief en kunnen verschillende kralen worden geplaatst binnen een neurale buis. Bovendien is de methode zorgt voor verdere ontwikkeling, zodat embryo's kunnen worden geanalyseerd op een meer volwassen stadium veranderingen in de anatomie en in neurale patronen op te sporen. Deze eenvoudige maar nuttige protocol zorgt voor real-time beeldvorming. Het biedt een manier om ruimte en tijd beperkte wijzigingen aan endogene eiwit niveaus.
Protocol
Discussion
Afhankelijk van de eiwitten die je wenst te gebruiken, zijn er verschillende protocollen over hoe de kralen te bereiden. In deze experimenten maken we gebruik van heparine-acryl kralen, maar Affi-gel kralen kunnen ook gebruikt worden. We hebben gevonden dat de heparine-acryl kralen zijn makkelijker te manipuleren in de waterige omgeving van de ei-albumine. Kralen zijn gedrenkt in 5 l eiwit overnacht bij 4 ° C. Controle kralen worden geplaatst in steriel PBS tot het moment van plaatsing. Het voordeel bij het gebruik van een in-ovo voo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
