Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo
Summary
Dit artikel beschrijft het oppervlak etikettering en de<em> Ex ovo</em> Weefselkweek in het begin van kippenembryo. Technieken ontvankelijk voor time-lapse helderveld, fluorescentie en optische coherentie tomografie beeldvorming worden gepresenteerd. Tracking oppervlak van etiketten met een hoge resolutie kunnen spatiotemporele kinematische grootheden als morfogenetische stammen (vervormingen) worden berekend in zowel twee en drie dimensies.
Abstract
Embryonale epitheel ondergaan complexe vervormingen (bijv. buigen, draaien, vouwen, en uitrekken) om de primitieve organen van het vroege embryo te vormen. Volgen de vaste markeringen op de oppervlakken van deze cellulaire bladen is een bekende methode voor het schatten van morfogenetische grootheden zoals groei, krimp, en afschuiving. Echter, niet alle oppervlakte-labeling technieken zijn makkelijk aan te passen aan conventionele beeldvorming en bezitten verschillende voordelen en beperkingen. Hier beschrijven we twee etikettering methoden en illustreren het nut van elke techniek. In de eerste methode, zijn honderden fluorescerende labels tegelijk toegepast op het embryo met behulp van magnetische ijzerdeeltjes. Deze labels worden vervolgens gebruikt om de hoeveelheid 2-D weefsel vervormingen tijdens de morfogenese. In de tweede methode, zijn polystyreen microsferen gebruikt als contrastmiddelen in niet-invasieve optische coherentie tomografie (OCT) beeldvorming naar 3-D weefsel vervormingen te volgen. Deze technieken zijn succesvolly geïmplementeerd in ons lab aan fysische mechanismen van de vroege hoofd vouwen, hart, en de ontwikkeling van de hersenen studythe, en moet worden aangepast aan een breed scala morfogenetische processen.
Protocol
Discussion
Twee weefsel labeling technieken worden gepresenteerd voor de ex ovo cultuur van de vroege kippenembryo's. De eerste maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen lipofiele geleverd via magnetische ijzerdeeltjes gelijktijdig label van honderden cellen. Echter, deze methode is momenteel niet compatibel met optische coherentie tomografie, als fluorescerende kleurstoffen vertonen over het algemeen weinig contrast van de omringende weefsels met behulp van 10 oktober. Daarom tonen we een alternatieve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen R01 GM075200 en R01 HL083393 (LAT). Wij erkennen fellowship ondersteuning van BAF van NIH T90 DA022871 en de Mallinckrodt Instituut voor Radiologie, en voor VDV uit te verlenen 09PRE2060795 van de American Heart Association.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
