Method Article

初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

DOI:

10.3791/3129

⸱

October 17th, 2011

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1Department of Biomedical Engineering, Washington University, 2Institute for Information Transmission Problems, Russian Academy of Sciences, 3Department of Mechanical Engineering and Materials Science, Washington University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、表面のラベルを説明し、 EX卵組織培養。タイムラプス明視野、蛍光、および光コヒーレンストモグラフィのイメージングへの従順の技術が提示されます。高い時空間分解能で追跡表面のラベルは、2次元および3次元の両方で計算される形態形成株（変形）として運動量を可能にします。

Abstract

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胚上皮は、初期胚の原始的な器官を形成するために複雑な変形を（例えば、ねじり、曲げ折り、そしてストレッチ）を行います。これらの細胞の板の表面上で基準マーカを追跡することはそのような成長、収縮、およびせん断などの形態形成量を見積もるための十分に確立された方法です。しかし、すべての面の標識技術は、従来の画像診断法に迅速に適用可能であり、異なる利点と限界を有していない。ここで、我々は2つ​​の標識方法を説明し、各手法の有用性を示しています。最初の方法では、蛍光ラベル、数百は、磁性鉄粒子を用いて胚に同時に適用されます。これらのラベルは、形態形成時の2次元組織の変形量に使用されます。第二の方法、ポリスチレン微小球で3次元組織の変形を追跡するために非侵襲的光コヒーレンストモグラフィー（OCT）画像で造影剤として使用されています。これらの技術は成功しているLYは、初期の頭の倍、心臓、および脳の発達の物理的メカニズムをstudytheに私たちのラボで実施され、広い範囲の形態形成のプロセスに適応可能でなければなりません。

Protocol

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1。一般的な実験の準備

  1. 層流フードの組織培養の培地を準備。
    1. ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（4.5グラム/ Lグルコース、重炭酸ナトリウム、およびL -グルタミンと1リットルの瓶）を希釈する。 10 mLのペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質を追加。
    2. 無菌トランスファーピペットでDMEM 100mLのを削除し、ニワトリ血清100mLで置き換えます。
    3. 滅菌済み15 mLコニカルバイアルと凍結に一定分量DMEM/10％ニワトリ血清/ 1％の抗生物質を。
  2. カルシウムとマグネシウムを添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 100 mLの10X PBS、900mLの脱イオン水、及び濃カルシウムとマグネシウム溶液（100 mg / mLの塩化カルシウム2•2H 2 O、100mg/mLのMgCl 2•6H 2 O）1 mLを混和します。
  3. ハンバーガーとハミルトン1（すなわち、23から25 HHステージ5のための時間、または42で定義されているように、目的のステージに縦向きに卵をインキュベートHHステージ11〜12）は、-48時間。
  4. ろ紙キャリア方式を使用して卵から胚を削除します。
    1. A150ミリメートルペトリ皿の側面に卵の底を割れる。下からシェルを離れて引いて、皿に卵の中身を空にし....

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Discussion

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二つの組織の標識技術は、初期のニワトリ胚の元OVO文化のために表示されている。最初は同時に細胞の数百をラベル付けする磁性鉄微粒子を介して配信蛍光親油性色素を使用しています。蛍光染料は一般的に10月10日を使って周囲の組織から少しコントラストを示すようにしかし、この方法は、現在、光コヒーレンストモグラフィーと互換性がありません。したがって、我々は、タイムラプスのOCT解析のための組織を標識するためにポリスチレン微小球を使用して別の方法を示しています。この手法は3次元のデータセットが得られますが、注意は、組織からビーズが剥がれないよう注意する必要があります。適切な実験設定でこれらのメソッドのいずれかを使用すると、初期胚における信頼性の高い組織のラベリングとEX OVO開発を提供する必要があります。どちらの方法もすぐに利用できる、比較的低コストの材料（例えば、鉄粉、ポリスチレン微小球）を使用し、形態形成の間に定量化する組織の変形を有効にします。市販どちらの場合も組織のマーカーを簡単にかつ再現性胚組織に適用することができ、フィールドでの新規参入者にこれらの実験にアクセスできるよう、特殊な.......

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Disclosures

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利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

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この作品は、NIHの助成金R01 GM075200とR01 HL083393（LAT）によってサポートされていました。我々は、NIH T90 DA022871と放射線のMallinckrodt研究所からBAFのための奨学金支援を認める、と米国心臓協会からの助成金09PRE2060795からVDV用。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
材料/試薬 会社 カタログ番号 コメント
DMEM - 高グルコースシグマアルドリッチ D5796
ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシンシグマアルドリッチ P4083
鶏血清インビトロジェン 16110-082
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水シグマアルドリッチ D1408 10X
ワットマン＃2濾紙ワットマン紙 1002 090 90ミリメートルの直径
ガラスのマイクロピペット世界の精密楽器（WPI） TW150 - 6 1.5ミリメートル、内径
DII インビトロジェン D - 282
鉄の減少 Mallinckrodtベイカー（株） 5320
10μmの直径ミクロスフェア（黒） Polysciences株式会社 24294
デルタTディッシュ（タイムラプス培養用） Bioptechs 04200415B 黒、厚さ0.17ミリメートル
デルタT4培養皿コントローラ Bioptechs 0420-4-03
ミニポンプ可変流量デバイスフィッシャーサイエンティフィック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  2. Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).

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