Suivi des déformations des tissus morphogénétiques dans l'embryon de poulet Early

Summary

Cet article décrit l'étiquetage de surface et<em> Ovo ex</emCulture de tissus> dans l'embryon de poulet au début. Techniques prêtent à time-lapse en champ clair, fluorescence et tomographie par cohérence optique d'imagerie sont présentés. Étiquettes de surface suivi de la résolution spatio-temporelle élevée permet des quantités cinématiques telles que les souches morphogénétiques (déformations) doit être calculé à la fois dans deux et trois dimensions.

Abstract

Embryonic épithélium subir des déformations complexes (par exemple flexion, de torsion, le pliage et étirement) pour former les organes primitifs de l'embryon précoce. Suivi des marqueurs fiduciaires sur les surfaces de ces feuilles cellulaire est une méthode bien établie pour l'estimation des quantités morphogénétiques tels que la croissance, la contraction et de cisaillement. Cependant, toutes les techniques de marquage de surface sont facilement adaptables aux modalités d'imagerie conventionnelles et possèdent différents avantages et ses limites. Ici, nous décrivons deux méthodes de marquage et d'illustrer l'utilité de chaque technique. Dans la première méthode, des centaines de marqueurs fluorescents sont appliquées simultanément à l'embryon en utilisant des particules de fer magnétique. Ces étiquettes sont ensuite utilisés pour la quantité déformations des tissus en 2-D lors de la morphogenèse. Dans la seconde méthode, microsphères de polystyrène sont utilisés comme agents de contraste chez les non-invasive tomographie par cohérence optique (OCT) d'imagerie pour suivre les déformations des tissus en 3-D. Ces techniques ont été couronnés de succèsment mis en œuvre dans notre laboratoire pour studythe mécanismes physiques de la tête fois au début, le cœur et le développement du cerveau, et devrait être adaptable à une large processus morphogénétiques gamme.

Protocol

1. Préparation générale expérimentale Préparer un milieu de culture de tissus dans la hotte à flux laminaire. Diluer milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) (bouteille de 1 L avec 4,5 g / L de glucose, bicarbonate de sodium et de L-glutamine). Ajouter 10 ml de pénicilline / streptomycine / néomycine antibiotiques. Retirer 100 ml de DMEM avec une pipette de transfert stérile et la remplacer par 100 ml de sérum de poulet. Aliquoter le poussin DMEM/10% de sérum / antibiotiqu…

Discussion

Deux techniques de marquage des tissus sont présentés pour la culture ex ovo d'embryons de poulet au début. La première utilise les colorants lipophiles fluorescents livrés par des particules de fer magnétique à la fois l'étiquette des centaines de cellules. Cependant, cette méthode n'est actuellement pas compatible avec la tomographie par cohérence optique, comme des colorants fluorescents montrent généralement peu de contraste dans les tissus environnants en utilisant le ^{10 octobr…}

Materials

Material / Reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Penicillin/Streptomycin/Neomycin	Sigma-Aldrich	P4083
Chicken Serum	Invitrogen	16110-082
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D1408	10X
Whatman #2 Filter Paper	Whatman	1002 090	90mm diameter
Glass Micropipettes	World Precision Instruments (WPI)	TW150-6	1.5mm inner diameter
DiI	Invitrogen	D-282
Iron Reduced	Mallinckrodt Baker Inc.	5320
10 μm Diameter Microspheres (black)	Polysciences Inc.	24294
Delta T Dish (for time lapse culture)	Bioptechs	04200415B	0.17mm thick, black
Delta T4 Culture Dish Controller	Bioptechs	0420-4-03
Mini-Pump Variable Flow Device	Fisher Scientific