ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製
Summary
我々は、感染細胞から高純度のヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAを単離するプロセスを説明します。ソリューションから取り込んだ最終的なDNAは、それが理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、および新たなウイルスの組換え体を生産するトランスフェクションに最適です、高濃度および純度である。
Abstract
ウイルスは絶対携帯寄生虫であり、そのため、DNAの研究では、離れて宿主細胞の汚染物質とDNAからのウイルス材料を分離する必要があります。いくつかの下流のアプリケーションでは、このプロトコルによって提供される純粋なウイルスDNA、大量のを必要とする。これらのアプリケーションは、ウイルスゲノムの宿主DNAの除去は、ウイルス配列のデータ出力を最適化するために重要であるシーケンシング、および新たなウイルスの組換え株の生産、プラスミドおよびリニアウイルスDNAの組換えを容易に精製されたの共トランスフェクション。1,2を、含まれています3
この手順では、感染細胞からリニアヘルペスウイルスヌクレオキャプシドのDNAを精製単離するために抽出し、密度ベースの遠心分離の組み合わせを採用しています。4,5初期精製ステップは、抽出と遠心操作中に含まれているとウイルスDNAを保護するウイルスキャプシドを、精製分離することを目指すことは、細胞タンパク質およびDNAを除去。ヌクレオカプシドの溶解は、ウイルスDNAを解放し、最後に2つのフェノール – クロロホルムの手順では、残りのタンパク質を除去。ソリューションから取り込んだ最後のDNAは1.90の平均OD 280分の260と、高濃度および純粋です。使用されて感染細胞の量に応じて、150から800μgの以上からウイルスDNAの範囲の収量。このDNAの純度は、4Cでの長期保管中にそれが安定したものになります。このDNAは、このように理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、およびトランスフェクションに適しています。
プロトコルを開始する前に、それは、ディッシュあたりの細胞（コンフルエント15cmの皿に8 × 10 6 PK – 15細胞の平均など）の平均数を知ることは重要です、そして、使用するウイルスストックの力価（例えば、ml当たり1 × 10 8プラーク形成単位を）。これらのプロトコルのために感染症の適切な多重度（MOI）を計算するために必要な。例えば6、上記のウイルスストックとPK – 15細胞の一つ15cmの皿に感染する、MOI 5の時には、400μlのを使用します。ウイルスストックと培地の3.6ミリリットル（一15cmのプレートに4 mlの総接種量）とそれを希釈する。
複数のウイルスDNAの調製物は、同時に調製することができる。同時の準備の数は、超遠心ローターで開催された管の数によって制限されます（ウイルスごとに、下記のステップ3.9を参照してください）。ここでは、つのウイルスのために行われているかのように手順を説明します。
Protocol
Discussion
このプロトコルの一部は、もともとBSL4条件におけるウイルスDNAの分離のために開発されたが、それは非BSL条件にも同様に適応された4我々は一般的にDNAゲノムを有するα-ヘルペスウイルスPRVおよびHSV – 1、からDNAを単離するためにこのプロトコルを使用キャプシドと脂質エンベロープに囲まれたタンパク質で囲みます。7,8しかし、それが含むβ-およびγ-ヘルペスウイルスやアデ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロトコルを微調整するにグレッグスミス、リサPomeranz、マットライマン、マルリースエルドリッジ、ハリナStaniszewska Goraczniak、およびEnquistラボのメンバーの貢献を感謝しています。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
References
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