Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması
Summary
Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.
Abstract
Virüsler zorunlu hücresel parazitler, ve böylece kendi DNA çalışma, konak hücre kirleticiler ve DNA viral malzeme izole gerektirir. Birkaç downstream uygulamalar bu protokolü tarafından sağlanan saf viral DNA, büyük miktarlarda gerektirir. Bu uygulamalar, viral genom konak DNA kaldırılması viral dizileri için veri çıkışı optimize etmek için çok önemlidir sıralama, ve yeni rekombinant virüs suşları üretimi, plazmid ve lineer viral DNA rekombinasyon kolaylaştırır saflaştırılmış co-transfeksiyon 1,2, 3
Bu prosedür, ekstraksiyon ve enfekte hücrelerden doğrusal herpesvirus nucleocapsid saflaştırılmış DNA izole etmek için yoğunluk tabanlı santrifüj bir kombinasyonunu kullanır. 4,5 ilk arıtma adımları ekstraksiyon ve santrifüj adımları sırasında viral DNA içermediğinden ve korumak, saflaştırılmış virüs capsids izole etmek amacı hücresel protein ve DNA kaldırmak. Nucleocapsids, Lizis sonra viral DNA açıklamaları ve son iki fenol-kloroform adımları kalan proteinler kaldırmak. Çözüm yakalanan son DNA, 1.90 ortalama OD 260/280 ile, son derece konsantre ve saf. Kullanılan enfekte hücreler, viral DNA aralığı 150-800 mg veya daha fazla verim miktarına bağlı olarak değişir. Bu DNA saflık 4C uzun süreli depolama sırasında istikrarlı hale getiriyor. Bu DNA böylece ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonları ve transfections için çok uygundur.
Protokol başlamadan önce, çanak başına hücre (örneğin konfluent 15 cm çanak ortalama 8 x 10 6 PK-15 hücreleri) ve viral stokunun titresi (ortalama sayısını bilmek önemlidir. örneğin 1 x 10 ml başına 8 plak oluşturan birim). Bu protokol için uygun enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamak için gereklidir. Örneğin 6, 5 bir İçişleri Bakanlığı Yukarıdaki viral stoğu ile PK-15 hücreleri, biri 15 cm çanak bulaştırmak için, 400 ul 3.6 ml (15 cm plaka için toplam aşılama hacmi 4 ml) orta ile viral stok ve sulandırmak.
Çoklu viral DNA preparatları aynı zamanda hazırlanabilir. Sadece ultrasantrifüjdeki rotor tarafından düzenlenen tüplerin sayısına göre eş zamanlı olarak hazırlıkları sayısı sınırlıdır (virüs başına bir adım aşağıda 3.9). Burada bir virüs için yapılıyor gibi prosedürü açıklar.
Protocol
Discussion
Bu protokol bölümleri başlangıçta BSL4 şartlarda viral DNA izolasyonu için geliştirilmiş, ancak bu eşit olmayan BSL koşulları iyi uyum 4. yaygın DNA genomların olan alfa-herpesvirüslerinin PRV ve HSV-1, DNA izole etmek için bu protokolü kullanan kapsid bir protein ve lipid bir zarf ile çevrili içine 7,8 Bununla beraber, beta ve gama-herpesvirüslerinin ve adenovirüs, büyük olasılıkla diğer büyük DNA virüsleri doğrudan uyarlanabilir. Benzer ekstraksiyon yaygın RNA virü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarları Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, Enquist laboratuvar ince ayar bu protokol üyeleri ve katkıları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
