Подготовка вирусных ДНК из нуклеокапсидов
Summary
Мы опишем процесс выделения высокой чистоты герпеса нуклеокапсида ДНК зараженных клеток. Окончательный ДНК захватили из раствора с высокой концентрацией и чистоты, что делает его идеально подходит для высокой пропускной последовательности, высокая точность ПЦР-реакции, и трансфекции производить новые вирусные рекомбинантов.
Abstract
Вирусы являются облигатными паразитами сотовой, и, следовательно, изучение их ДНК требует выделения вирусного материала от клетки-хозяина загрязняющих веществ и ДНК. Несколько ниже по течению приложения требуют большого количества чистой вирусной ДНК, которая предоставляется этим протоколом. Эти приложения включают вирусные секвенирования генома, где удаление ДНК хозяина имеет решающее значение для оптимизации вывода данных вирусных последовательностей и производства новых вирусных рекомбинантных штаммов, где котрансфекцию очищенной плазмиды и линейных вирусной ДНК способствует рекомбинации. 1,2, 3
Эта процедура использует сочетание экстракции и плотности основе центрифугирования, чтобы изолировать очищенный линейный герпеса нуклеокапсида ДНК зараженных клеток. 4,5 начальной стадии очистки целью изолировать очищенной вирусной капсиды, которые содержат и защищают вирусной ДНК во время экстракции и центрифугирования шаги , которые удаляют клеточных белков и ДНК. Лизис нуклеокапсидов затем освобождает вирусной ДНК, и два последних фенол-хлороформ шаги удалить остатки белков. Окончательный ДНК захватили из раствора является высоко концентрированным и чистый, со средним диаметром 260/280 от 1.90. В зависимости от количества инфицированных клеток использовали, дает вирусных ДНК из диапазона 150-800 мкг и более. Чистоту этого ДНК делает ее стабильной в течение длительного хранения при 4С. Эта ДНК, таким образом, идеально подходит для высокой пропускной последовательности, высокая точность ПЦР-реакции, и трансфекции.
До начала протокола, важно знать среднее число клеток на блюдо (например, в среднем на 8 х 10 6 PK-15 клеток в сливной 15 см блюдо), и титр вирусной акции, которые будут использоваться ( например, 1 х 10 8 бляшкообразующих единиц на мл). Они необходимы для расчета соответствующей множественности заражения (МВД) для протокола. 6 Например, чтобы заразить 15 см блюдо PK-15 ячеек с выше вирусная акция, в МВД 5, вы должны использовать 400 мкл вирусные акции и развести его с 3,6 мл среды (общий объем инокуляции 4 мл для одного 15 см пластины).
Несколько вирусных препаратов ДНК может быть подготовлен в то же время. Количество одновременных препаратов ограничено только количество трубок проводимых ультрацентрифуге ротора (по одному на вирус, см. шаг 3,9 ниже). Здесь мы опишем процедуру, как будто делается для одного вируса.
Protocol
Discussion
Части этого протокола первоначально были разработаны для выделения вируса в ДНК BSL4 условиях, но он одинаково хорошо адаптируется к не-BSL условиях. 4 Мы часто используют этот протокол, чтобы изолировать ДНК из альфа-PRV герпеса и ВПГ-1, которые имеют ДНК геномов заключен в белковый ка?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы ценят вклад Грег Смит, Лиза Померанц, Мэтт Лиман, Марлиз Элдридж, Галина Staniszewska Goraczniak, и члены лаборатории Enquist в тонкой настройки этого протокола.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
