Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Summary

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Abstract

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. ^{1,2, 3}

Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. ^4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de _260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections.

Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 ⁶ células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 ⁸ unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. ⁶ Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm).

Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.

Protocol

1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV). Quando as células são 95 – confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. P…

Discussion

Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. ⁴ Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. ^7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semel…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane)	Fisher	T178-4	Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9
Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity	5 PRIME	2302850	Optional
Polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman*	331372*	*Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only
NP-40 / IGEPAL	Sigma	I-3021
PK-15 cells	ATCC	CCL-33
Vero cells	ATCC	CCL-81
PBS	HyClone	SH30028.03