Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering
Summary
De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.
Abstract
De muis is een belangrijke eye genetisch model voor de studie van menselijke translationele oogziektes. Blinding ziekten bij de mens, zoals maculadegeneratie, fotoreceptor degeneratie, cataract, glaucoom, retinoblastoom, en diabetische retinopathie zijn samengevat in transgene muizen. Een-vijf meeste transgene en knock-out muizen zijn van laboratoria die aan niet-oogheelkundige aandoeningen te bestuderen, maar genetische conservering tussen orgaansystemen suggereert dat veel van dezelfde genen kunnen ook een rol spelen bij ontwikkeling en oculaire ziekte. Vandaar dat deze muizen vormen een belangrijke bron voor het ontdekken van nieuwe genotype-fenotype correlaties in het oog. Omdat deze muizen zijn verspreid over de hele wereld, is moeilijk te verwerven, onderhouden en fenotype ze op een efficiënte en kosteneffectieve manier. Zo zijn de meeste high-throughput oogheelkundige fenotypering schermen beperkt tot enkele locaties die nodig on-site, oogheelkundige expertise om de ogen te onderzoeken in levende muizen. 6-9 Een alternatieve benadering die door ons laboratorium is een werkwijze voor remote weefsel acquisitie die gebruikt kunnen worden in kleine of grote schaal onderzoek van transgene muizen ogen. Gestandaardiseerde procedures voor video-gebaseerde chirurgische vaardigheden overdracht, weefsel fixatie, en de scheepvaart ervoor dat er geen lab op hele ogen te verzamelen van gemuteerde dieren en stuur ze voor de moleculaire en morfologische fenotypering. In deze video artikel zullen we technieken om ophelderen en zowel losgemaakte en perfusie vaste muis ogen dragen voor het op afstand fenotypering analyses.
Protocol
Discussion
De meeste transgene muizen bestaan in laboratoria die niet onderzoekt de ogen. Onze video-techniek illustreert een eenvoudige, gestandaardiseerde methode voor het op afstand chirurgische vaardigheid transfer naar weefsel overname optimaliseren van laboratoria met weinig ervaring met de ogen. Deze techniek helpt video overwinnen belangrijke valkuil in high-throughput fenotypering, die het gebruik van een beperkt aantal locaties deskundige door niet-gestandaardiseerde weefselverzameltoestel en bevestigingsmethoden d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek naar blindheid te voorkomen; Bartly J. Mondino MD, directeur van het Jules Stein Eye Institute, UCLA, en Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui Wit, en Jeanne Estabel aan het Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Dit onderzoek voldoet aan de Arvo verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. . In Research Methods For Mutant Mice. , (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
