Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota
Summary
A técnica de dissecção ilustra enucleação do olho do rato para fixação do tecido para realizar fenotipagem em alto rendimento telas.
Abstract
O olho do rato é um modelo genético importante para o estudo da doença de translação oftálmica humana. Doenças que causam cegueira em humanos, tais como a degeneração macular, a degeneração de fotorreceptores, cataratas, glaucoma, retinoblastoma, e retinopatia diabética foram recapitulado em ratinhos transgénicos. 1-5 ratinhos transgénicos e knockout maioria foram gerados por laboratórios para estudar doenças não oftálmicas, mas conservação genética entre os sistemas de órgãos sugere que muitos dos mesmos genes podem também desempenhar um papel no desenvolvimento ocular e doenças. Assim, estes ratos representam um recurso importante para a descoberta de novas correlações genótipo-fenótipo no olho. Porque esses ratos estão espalhados por todo o mundo, é difícil de adquirir, manter e fenótipo-los de forma eficiente, boa relação custo-benefício. Assim, a maioria de alto rendimento telas fenotipagem oftálmicas são restritos a alguns locais que necessitam no local, a perícia oftalmológica para examinar os olhos em camundongos vivos. 6-9 Uma abordagem alternativa desenvolvida pelo nosso laboratório é um método para o controle remoto de aquisição tecido que pode ser utilizado em estudos de grandes dimensões ou de pequena escala de olhos de ratinhos transgénicos. Procedimentos padronizados para vídeo baseado em transferência de habilidade cirúrgica, fixação do tecido, e transporte permitem que qualquer laboratório para coletar olhos inteiros de animais mutantes e enviá-las para fenotipagem molecular e morfológica. Neste artigo de vídeo, nós apresentamos técnicas para enuclear e transferir ambos não corrigidos e perfusão olhos de rato fixos para análises fenotípicas remotos.
Protocol
Discussion
Camundongos transgênicos mais existem em laboratórios que não examinam os olhos. Nossa técnica vídeo mostra um método simples e padronizada para a transferência remota de habilidade cirúrgica para otimizar a aquisição de tecidos a partir de laboratórios com pouca experiência com os olhos. Esta técnica de vídeo ajuda a superar um grande armadilha em alto rendimento fenotipagem, que é a utilização de um número limitado de locais especializados devido a métodos não normalizados de recolha de tecidos e q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa para prevenir a cegueira; Bartly J. Mondino MD, Diretor do Jules Stein Eye Institute, UCLA, e Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui Branco, e Jeanne Estabel no Instituto Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. . In Research Methods For Mutant Mice. , (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
