Mus Eye enucleation för Remote hög kapacitet Fenotypning
Summary
Dissektion Tekniken visar enucleation av musen öga för vävnadsfixering att utföra fenotypning i hög genomströmning skärmar.
Abstract
Musen ögat är en viktig genetisk modell för translationella studier av mänsklig oftalmisk sjukdom. Bländande sjukdomar hos människor, såsom makuladegeneration, ljusmätare degeneration, katarakt, glaukom, retinoblastom, och diabetesretinopati har rekapituleras i transgena möss. 1-5 flesta transgena och knockout möss har genererats av laboratorier för att studera icke-ögonsjukdomar, men genetisk bevarande mellan organsystem tyder på att många av de samma gener också kan spela en roll i okulär utveckling och sjukdom. Därför är dessa möss utgör en viktig resurs för att upptäcka nya genotyp-fenotyp korrelationer i ögat. Eftersom dessa möss är utspridda över hela världen, är det svårt att få, underhålla och fenotyp dem på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt. Således är de flesta hög kapacitet oftalmiska fenotypning skärmar begränsad till ett fåtal platser som kräver på plats, oftalmisk expertis för att undersöka ögonen på levande möss. 6-9 Ett alternativt tillvägagångssätt som utvecklats av vårt laboratorium är en metod för avlägsen vävnads-förvärv som kan användas i stora eller små skala undersökningar av transgen mus ögon. Standardiserade förfaranden för video-baserade kirurgiska kunskapsöverföring, vävnad fixering och sjöfart tillåta labb för att samla hela ögon muterade djur och skicka dem för Molekylär och morfologisk fenotypning. I den här videon artikeln presenterar vi tekniker för att enucleate och överföra både ofixerade och perfusion fasta mus ögon för avlägsna fenotypning analyser.
Protocol
Discussion
De flesta transgena möss finns i laboratorier som inte undersöka ögonen. Vår videoteknik illustrerar en enkel, standardiserad metod för fjärrstyrning kirurgisk kunskapsöverföring för att optimera mjukpappersförvärvet från laboratorier med liten erfarenhet med ögonen. Denna video teknik hjälper övervinna en stor fallgrop i hög genomströmning fenotypning, vilket är användningen av ett begränsat antal experter platser på grund av icke-standardiserade vävnad insamling och fixering metoder som hindrar m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning för att förhindra blindhet, Bartly J. Mondino MD, chef för Jules Stein Eye Institute, UCLA och Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White och Jeanne Estabel på Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Denna forskning uppfyller ARVO uttalande för användning av djur i Ophthalmic och Visual Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. . In Research Methods For Mutant Mice. , (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
