인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)
Summary
암종 – 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
Carcinomas는 종양 세포의 '기질'이라고 비 암 구획 구성되어 복잡한 조직입니다. 기질은 세포외 기질 (ECM) 및 섬유아 세포, myofibroblasts, 내피 세포, pericytes과 1-3 leukocytes을 포함 mesenchymal 세포의 다양한 구성되어 있습니다.
종양 – 관련 기질은 인근 암종 세포에 의해 발표 상당한 paracrine 신호에 반응합니다. 질병 과정 동안 기질은 종종 myofibroblasts 다수 포함하는 암종 – 관련 섬유아 세포 (CAFs)에 의해 인구가됩니다. 이러한 세포는 이전에 자신의 체외 문화에 대한 인간의 carcinomas 다양한 종류의에서 추출되었습니다. CAFs의 subpopulation는 α – 부드러운 근육 굴지 자신의 최대 규제 (α – SMA) 표현 4,5 통해 구별할 수 있습니다. 이러한 세포들은 myofibroblasts C와 유사한 특성을 공유하는 '활성화 섬유아 세포'의 특징 아르ommonly 부상하고 fibrotic 조직 6 보여집니다. 이 myofibroblastic CAF 집합의 존재는 매우 고급 malignancies 관련하여 환자의 가난한 prognoses와 관련된 것입니다.
우리 자신을 포함한 많은 실험실, CAFs, immunodeficient 마우스로 암종 세포로 주입, 크게 tumourigenesis 70-10을 추진 능력이있다 것으로 나타났습니다. 암종 환자에서 준비 CAFs 그러나, 자주 지속적인 실험을 통해 자신의 이용을 제한 extensiveness 문화에 전파하는 동안 노화를 받고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 coimplantation의 유방 종양의 이종 이식 모델을 사용하여 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary 불후의 인간 mammary CAF 셀 라인 (EXP – CAFs) 생성 소설 기법을 개발했습니다.
감소 mammoplasty 조직에서 얻은 EXP – CAFs, 부모 mammary 인간 섬유아 세포를 생성하기 위해서는 먼저 immortali되었습니다hTERT, telomerase의 holoenzyme의 촉매 subunit와 표현 GFP 및 puromycin 저항 유전자에 설계와 함께 SED. 이러한 세포는 이종 이식 마우스에 활성 RAS의 oncogene (MCF – 7 – RAS 세포)를 표현 MCF – 7 인간 유방암 세포 암종과 coimplanted되었습니다. 생체내의 배양 기간 후, 처음 주입 인간 mammary 섬유아 세포들은 puromycin 저항 11에 기초하여 종양의 xenografts에서 추출한되었습니다.
우리는 myofibroblastic 표현형을 채택, 상주 인간 mammary 섬유아 세포가 차별화된 것을 관찰하고 종양의 진행 과정 동안 종양 – 홍보 속성을 인수했다. 중요한 것은,이 세포는 EXP – CAFs로 정의, 가깝게 환자에서 해부하는 유방 carcinomas으로부터 격리 CAFs의 종양 – 홍보 myofibroblastic 표현형을 모방. 우리 종양 이종 이식 – 파생 EXP – CAFs 따라서 인간 부러 뜨려에 CAFs의 생물학을 공부하는 효과적인 모델을 제공합니다t의 carcinomas. 설명 프로토콜은 또한 인간의 carcinomas의 다른 유형에서 파생된 다양한 카페의 인구를 생성 및 특성화 연장 수 있습니다.
Protocol
Discussion
CAFs이 셀 유형 자체가 도전의 특성을 렌더링 사이 CAF 특정 마커와 이질 수준의 부족 관찰했다. 체외에서 공부 CAFs 또한 이러한 세포가 senesce하고 오랜 기간 동안 교양 때 proliferating 중지되는 추가 합병증에 의해 방해되었다. 직접 retroviral hTERT cDNA 구조를 사용하여 기본 CAFs을 immortalise에 대한 우리의 이전의 시도가 실패했습니다. 따라서 더 이상 이러한 세포의 특성을 홍보하는 종양을 조사하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 작품이 원고의 중요한 편집을 위해 씨 Kieran Mellody (맨체스터 대학, 맨체스터)의 관대한 지원과 감독에 대한 박사 로버트 A. 와인버그 (바이오 메디컬 연구, 케임 브리지에 대한 화이트 헤드 연구소)을 주셔서 감사합니다. 이 프로젝트는 연구 영국 (CR – 영국) 부여 번호 C147/A6058 (AO)에 의해 지원되었다
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
References
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