Summary

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Published: October 25, 2011
doi:

Summary

Karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tümör stroma içinde mevcut miyofibroblastlar zengin, tümör progresyonu sürüş önemli bir rol oynamaktadır. Biz deneysel insan meme fibroblastlar CAFs üretmek için bir coimplantation tümör xengraft modeli geliştirdi. Protokolü tumourigenesis teşvik etmek için bir yeteneği kazandırmak CAF miyofibroblastlar kurmak anlatılmaktadır.

Abstract

Karsinomlar neoplastik hücreler ve 'stroma' olarak anılan bir kanser olmayan gözü oluşan karmaşık dokulardır. Stroma ekstrasellüler matriks (ECM) ve mezenkimal hücreler, fibroblastlar, miyofibroblastlar endotel hücreleri, perisitlerden ve 1-3 lökosit de dahil olmak üzere , çeşitli oluşur.

Tümör ile ilişkili stroma komşu karsinom hücreleri tarafından yayımlanan önemli parakrin sinyaller duyarlı. Hastalık süreci boyunca, stroma genellikle miyofibroblastlar büyük numaraları da dahil olmak üzere, karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tarafından doldurulur olur. Bu hücreler in vitro kültürü için daha önce birçok farklı insan karsinomların tipleri çıkarılan edilmiştir. CAFs bir ICSI'nin α-düz kas aktin up-regülasyon (α-SMA) ifade 4,5 ile ayırt edilebilir. Bu hücreler miyofibroblastlar c ile benzer özellikleri paylaşan bir işaretidir 'aktif fibroblastlar'ommonly yaralı ve fibrotik dokuların 6 gözlenmiştir. Bu miyofibroblastik CAF alt kümesinin varlığı son derece yüksek dereceli maligniteler ile ilgili ve yoksul hastaların prognozları ile ilişkilidir.

Birçok laboratuar, kendi de dahil olmak üzere CAFs karsinom hücreleri ile bağışık yetmezliği olan farelere enjekte tumourigenesis 7-10 önemli ölçüde teşvik yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Ancak karsinom hastaları hazırlanan CAFs,, sık sık devam eden deney boyunca kullanım yaygınlığı sınırlayıcı kültürünün yayılma sırasında yaşlanması tabi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, biz coimplantation meme tümörü xenograft modeli kullanılarak, deneysel insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi meme insan CAF hücre hatları (exp-CAFs) oluşturmak için yeni bir teknik geliştirdi.

Azalma mammoplasty doku elde exp CAFs, ebeveyn insan meme fibroblastlar, üretmek için, ilk immortalihTERT, telomeraz holoenzyme katalitik subunit ve ifade GFP ve bir puromycin direnç geninin için tasarlanmış sed. Bu hücreler aktive ras onkogen (MCF-7-ras hücreleri) bir fare xenograft ifade MCF-7 insan meme kanseri hücreleri ile coimplanted. In vivo bir inkübasyon döneminden sonra, başlangıçta enjekte insan meme fibroblastlar, onların puromycin direnci 11 temelinde tümör xenografts çıkarıldı .

Biz bir miyofibroblastik fenotip benimseyerek, yerleşik insan meme fibroblastlar farklılaşmış olduğu görülmektedir ve tümör progresyonu sırasında tümör destekleyici özellikleri satın aldı. Önemlisi, bu hücrelerin, exp-CAFs olarak tanımlanan yakından hastaların disseke meme karsinomları izole CAFs tümör teşvik miyofibroblastik fenotip taklit. Bu nedenle tümör xenograft türetilen exp CAFs, insan breas CAFs biyolojisini çalışmak için etkili bir modelt karsinomlar. Açıklanan protokol aynı zamanda, insan karsinomları diğer türleri türetilen çeşitli CAF popülasyonları ve tanımlamak için uzatılabilir.

Protocol

1. Primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar izolasyonu Şekil izole primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar için deneysel prosedürleri özetlenmiştir. 1A. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) gibi daha önce 12 açıklanan hücre disosiasyon tampon,% 10 fetal buzağı serumu (FCS), penisilin-streptomisin (200 üniteler / ml), kollajenaz tip I (1 mg / ml) ve hiyalüronidaz (hazırlayın 125 ünite / ml). Meme …

Discussion

CAFs bu hücre tipi kendi içinde bir meydan okuma karakterizasyonu hale arasından CAF-spesifik belirteçler ve heterojenlik eksikliği görülmektedir. In vitro olarak incelenmesi CAFs, ayrıca bu hücrelerin senesce ve uzun bir süre için kültüre prolifere ek bir komplikasyon engel olmuştur. Retroviral hTERT cDNA inşa kullanarak birincil CAFs doğrudan ölümsüzleştirmek için önceki girişimi başarısız oldu. Bu nedenle, bu hücrelerin tümör arttırıcı özellikleri daha fazla araştırmak içi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr Robert A. Weinberg (Whitehead Biyomedikal Araştırma, Cambridge Enstitüsü) Biz, bu iş ve bu yazının kritik düzenleme için Sayın Kieran Mellody (Manchester Üniversitesi, Manchester) cömert destek ve denetim için teşekkür ederim. Bu proje Research UK (CR-UK) hibe sayısı C147/A6058 (AO) tarafından desteklenen

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMEM   Invitrogen 61965-026  
Fetal calf serum   GIBCO 10270  
Penicillin-streptomycin   Invitrogen 15140-122  
Collagenase type I   Sigma C0130-1G  
hyaluronidase   Sigma H4272  
Vimentin (V9) antibody   Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
 
Tenascin C (BC-8) antibody      

a gift from
 Dr. Luciano

 Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody   Sigma C6198  

Prolyl-4-hydroxylase

  Dako M0877  
(5B5) antibody        
Collagen type1 1A antibody   Sigma HPA011795  
Pan-cytokeratin antibody   Sigma C5992  
Fibronectin antibody   BD Biosciences 610077  

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
  Dako A5114  

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
  Abcam ab11333  
MSCV-IRES-GFP construct       Request to the the authors
pBabe-puro construct      

Purchase

from Addgene
Puromycin   Sigma P8833  
DAPI   Sigma D9564  
15 ml conical tube   Corning 430766  
Nude mouse   Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells   ATCC   CCL-226

References

  1. Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?. Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
  2. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
  3. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  4. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  5. De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
  6. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
  7. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
  10. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
  11. Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
  12. Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
check_url/3201?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

View Video