ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）
Summary
腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。
Abstract
癌は、腫瘍細胞と"質"と呼ばれる非癌コンパートメントで構成される複雑な組織です。間質は、細胞外マトリックス（ECM）と1-3線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞と白血球を含む間葉系細胞が、様々な構成されています。
腫瘍関連間質には、近隣の癌細胞から放出される実質的なパラクリン信号に応答する。病気のプロセスの間、間質は、しばしば筋線維芽細胞の多数を含む、癌関連線維芽細胞（CAFS）によって人口になります。これらの細胞は、以前はそれらのin vitroでの培養のためのヒト癌の多くの異なる種類から抽出されています。 CAFSの亜集団は、4,5、そのα-平滑筋アクチンのアップレギュレーション（α- SMA）の発現を介して識別可能である。これらの細胞は、筋線維芽細胞Cと同様の性質を共有する"活性化線維芽細胞"の特徴です。ommonly負傷したと線維性組織6で観察された。この筋線維芽CAFのサブセットの存在は非常に高品位な悪性腫瘍に関連し、患者の予後不良に関連付けられています。
私たち自身を含む多くの研究室では、、CAFS、免疫不全マウスに癌細胞を注入、大幅に腫瘍形成7-10を促進することができることが示されている。癌患者から調製CAFSは、しかし、頻繁に継続的な実験を通してそれらの使用の広範さを制限する文化の伝播中に老化を受ける。この困難を克服するために、我々はcoimplantationの乳房の腫瘍の異種移植モデルを用いて、実験的にヒト乳腺線維芽細胞から不死化したヒト乳腺CAF細胞株を（EXP – CAFS）を生成するための新しい技術を開発。
EXP – CAFSを生成するためには、リダクションの乳房形成組織から得られた親のヒト乳腺線維芽細胞は、最初immortaliいたテロメラーゼ、テロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット、およびGFPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子に設計さとSED。これらの細胞は、マウス異種移植に活性化rasがん遺伝子（MCF – 7 – rasの細胞）を発現するMCF – 7ヒト乳癌細胞でcoimplantedていた。 in vivoでのインキュベーション期間の後、最初に注入されたヒト乳腺線維芽細胞は、それらのピューロマイシン耐性11に基づいて腫瘍の異種移植片から抽出された。
我々は、筋線維芽細胞表現型を採用し、常駐ヒト乳腺線維芽細胞が分化したことを観察し、腫瘍の進行の過程で腫瘍促進特性を取得した。重要なことは、これらの細胞は、EXP – CAFSとして定義されて、密接に患者から切除した乳癌から分離されたCAFSの腫瘍促進筋線維芽細胞表現型を模倣する。私たちの腫瘍異種移植片由来のEXP – CAFSしたがって人間breasでCAFSの生物学を研究するために効果的なモデルを提供tの癌。記述されたプロトコルはまた、ヒト癌の他の型から派生した様々なCAFの集団を生成し、特徴付けるために延長することができる。
Protocol
Discussion
CAF -特異的マーカーとCAFSの間で観察された不均質性のレベルの欠如は、この細胞型自体の課題の特性評価をレンダリングする。 in vitroで研究するCAFSはまた、これらの細胞が老化し、長期間培養すると増殖が停止する追加の合併症によって妨げられている。直接レトロウイルステロメラーゼcDNA構築物を使用して、プライマリCAFSをimmortaliseに私たちの以前の試みは失敗しました。したが?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この原稿の重大な編集にはこの作業の寛大な支援と監督のロバートA.ワインバーグ（ホワイトヘッドバイオ医療研究所、ケンブリッジ）と氏キーランMellody（マンチェスター大学、マンチェスターの）感謝。このプロジェクトは、研究英国（CR -英国）承認番号C147/A6058（AO）によってサポートされていました
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
References
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