ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA
Summary
הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.
Abstract
רנ"א (miRNAs) הם משפחה גדולה של ~ 22 נוקלאוטידים (NT) זמן מולקולות RNA אשר באים לידי ביטוי נרחב אאוקריוטים 1. הגנום מורכב לקודד לפחות מאות miRNAs, אשר בראש ובראשונה לדכא את הביטוי של מספר רב של גני מטרה שלאחר transcriptionally 2, 3. miRNAs לשלוט במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1. בנוסף, הביטוי מירנה שינה נמצא קשור מחלות אנושיות, כגון סרטן, ואת miRNAs עשוי לשמש סמנים למחלות הפרוגנוזה 4, 5. חשוב, אפוא, להבין את הביטוי פונקציות של miRNAs בתנאים שונים.
שלוש הגישות העיקריות היו מועסקים לביטוי פרופיל מירנה: PCR בזמן אמת, microarray, וסדר עמוק. הטכניקה של microarray מירנה יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה, בדרך כלל פחות יקר, ורוב הפעולות הניסוי וניתוח ניתן קארied החוצה במעבדה לביולוגיה מולקולרית במרבית האוניברסיטאות, בתי ספר לרפואה ובתי חולים הקשורים. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע אישית microarray ניסויים מירנה. מערכת בדיקה מירנה יודפסו על שקופיות זכוכית כדי לייצר microarrays מירנה. רנ"א הוא מבודד באמצעות שיטה או מגיב ששומרת קטן מינים RNA, שכותרתו אז עם צבע פלואורסצנטי. כמו שליטה, DNA התייחסות oligonucleotides המקביל משנה של miRNAs מסומנים גם עם צבע פלואורסצנטי שונים. ה-DNA התייחסות ישמש כדי להדגים את האיכות של השקופית ואת ההכלאה ואת ישמש גם לנורמליזציה נתונים. רנ"א ודנ"א הם מעורבים הכלאה לשקופית המכילה microarray בדיקות עבור רוב miRNAs במסד הנתונים. לאחר הכביסה, להחליק את נסרק להשיג תמונות, בעוצמות של מקומות מסוימים לכימות. אותות אלה הגלם יעובדו נוסף ניתח את הנתונים ביטוי miRNAs המקביל. Microaמגלשות rray ניתן הפשיטו מחדש כדי להפחית את העלות של microarrays כדי לשפר את העקביות של ניסויים microarray. אותם עקרונות ונהלים החלות על סוגים אחרים של ניסויים microarray אישית.
Protocol
Discussion
למרות ההתקדמות עמוק טכנולוגיות רצף, microarray נשאר בחירה מעשית עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA ו-RNA. בהשוואה רצף עמוק, ניסויים microarray זולים, וכן מעבדה לביולוגיה מולקולרית טיפוסי יכול לבצע את רוב הניסויים ניתוח נתונים בתוך הבית, אשר מאפשר גמישות חוסך זמן. בעתיד, סביר להניח microarra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מרכז (P50 התובע 011,806) ו צבא ארצות הברית מחלקת ההגנה (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
References
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
