Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Summary

Ein einfaches Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte microRNA Microarray-Experimenten beschrieben. Die Schritte umfassen Isolierung von RNA, die Kennzeichnung RNA und DNA-, Hybridisierung der Proben auf Microarrays, Scannen der Microarrays, Quantifizierung und Analyse Hybridisierungssignale.

Abstract

microRNAs (miRNAs) sind eine große Familie von ~ 22 Nukleotiden (nt) lange RNA-Moleküle, die weit in Eukaryoten ¹ sind ausgedrückt. Komplexer Genome kodieren mindestens Hunderte von miRNAs, die in erster Linie hemmt die Expression einer Vielzahl von Zielgenen posttranskriptional ^{2, 3.} miRNAs Steuerung einer breiten Palette von biologischen Prozessen ^1. Darüber hinaus hat sich verändert miRNA-Expression mit menschlichen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht worden, und miRNAs können als Biomarker für Krankheiten und die Prognose ^{4, 5} dienen. Es ist daher wichtig, um die Expression und Funktion von miRNAs unter vielen verschiedenen Bedingungen zu verstehen.

Real-time PCR, Microarray und deep sequencing: Drei große Ansätze zum Profil miRNA-Expression eingesetzt. Die Technik der miRNA-Microarray hat den Vorteil, dass High-Throughput, in der Regel weniger teuer, und die meisten der experimentellen und Analyseschritte können carr werdenin einem molekularbiologischen Labor an den meisten Universitäten, medizinischen Fakultäten und die damit verbundenen Krankenhäusern IED. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte miRNA Microarray-Experimenten. Ein miRNA-Sonde gesetzt werden auf Glasträger gedruckt werden, um miRNA-Mikroarrays herzustellen. RNA isoliert mit einer Methode oder Reagenz, dass kleine RNA-Spezies konserviert und anschließend mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Als Kontrolle werden Referenz-DNA-Oligonukleotide entsprechend einer Untergruppe von miRNAs auch mit einer anderen Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die Referenz-DNA wird dazu dienen, die Qualität der Folie und Hybridisierung zu demonstrieren und auch für Daten Normalisierung verwendet werden. Die RNA und DNA werden gemischt und hybridisierte mit einer Microarray-Folie mit Sonden für die meisten der miRNAs in der Datenbank. Nach dem Waschen wird die Folie gescannt, um Bilder zu erhalten, und Intensitäten der einzelnen Spots quantifiziert. Diese Roh-Signale werden weiter verarbeitet und analysiert werden, wie der Ausdruck von Daten der entsprechenden miRNAs. MicroArray Folien können entfernt und regeneriert werden, um die Kosten von Microarrays zu reduzieren und die Konsistenz der Microarray-Experimente zu verbessern. Die gleichen Grundsätze und Verfahren sind für andere Arten von benutzerdefinierten Microarray-Experimenten.

Protocol

1. Drucken von benutzerdefinierten miRNA-Mikroarrays Drucken Sie die Microarray-Slides mit Hilfe der Microarray-core facility services an einer Universität oder eines Unternehmens. Die Qualität der Microarray-Herstellung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg eines Mikroarray-Experiment. Probieren Sie ein paar Dienste, wenn möglich. Idealerweise würde man 50-100 Dias zu einem Zeitpunkt, zu drucken und alle Folien werden identisch aussehen, mit gut voneinander getrennt, die einzelnen Spots. </l…

Discussion

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Deep-Sequencing-Technologien, bleibt Microarray eine gute Wahl für High-Throughput-Analyse von DNA und RNA. Im Vergleich zum tiefen Sequenzierung sind Microarray-Experimenten billiger, und ein typischer Molekularbiologie-Labor können die meisten der Experimente und Datenanalyse in-Haus, das für Flexibilität erlaubt und spart Zeit durchzuführen. In der Zukunft, Microarrays wahrscheinlich gut geeignet, um intensiv zu befragen Gruppen von Genen, z. B. sind, können alle oder ein…

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent