Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

Summary

Una semplice procedura di eseguire esperimenti microarray su ordinazione microRNA è descritto. I passaggi includono isolare RNA, l'etichettatura RNA e DNA di riferimento, ibridando i campioni di microarray, la scansione del microarray, quantificare e analizzare segnali di ibridazione.

Abstract

microRNA (miRNA) sono una grande famiglia di circa 22 nucleotidi (nt) lungo molecole di RNA che sono ampiamente espresse in eucarioti ^1. Genomi complessi codificare almeno centinaia di miRNA, che in primo luogo inibire l'espressione di un vasto numero di geni bersaglio post-trascrizionalmente ^{2, 3.} miRNA controllare una vasta gamma di processi biologici ^1. Inoltre, l'espressione di miRNA alterata è stata associata a malattie umane come i tumori, e miRNA possono servire come biomarcatori per le malattie e la prognosi ^{4, 5.} E 'importante, quindi, per capire l'espressione e le funzioni dei miRNA in diverse condizioni.

Tre approcci principali sono stati impiegati per profilo di espressione di miRNA: real-time PCR, microarray e sequenziamento profondo. La tecnica dei microarray miRNA ha il vantaggio di essere high-throughput, generalmente meno costose, e la maggior parte delle fasi sperimentali e di analisi può essere carrIED in un laboratorio di biologia molecolare alla maggior parte delle università, scuole di medicina e gli ospedali associati. Qui, descriviamo un metodo per l'esecuzione di esperimenti microarray su ordinazione miRNA. Un insieme sonda miRNA verrà stampato su vetrini microarray per produrre miRNA. RNA è isolato utilizzando un metodo o reagente che conserva le piccole specie di RNA, e poi etichettato con un colorante fluorescente. Come controllo, oligonucleotidi DNA di riferimento corrispondente a un sottoinsieme dei miRNA sono etichettati con un colorante diverso fluorescenza. Il DNA di riferimento servirà per dimostrare la qualità della diapositiva e l'ibridazione e sarà anche utilizzata per la normalizzazione dei dati. L'RNA e DNA si mescolano e ibridato a una diapositiva microarray contenenti sonde per la maggior parte dei miRNA nel database. Dopo il lavaggio, la diapositiva viene sottoposto a scansione per ottenere immagini e intensità dei punti individuali quantificati. Questi segnali prime saranno ulteriormente elaborati e analizzati i dati di espressione dei miRNA corrispondente. MicroArray diapositive possono essere rimossi e rigenerata per ridurre i costi di microarray e di migliorare la coerenza degli esperimenti microarray. Gli stessi principi e le procedure sono applicabili ad altri tipi di esperimenti microarray su ordinazione.

Protocol

1. Stampa di microarray miRNA personalizzate Stampare il microarray diapositive utilizzando i servizi di base impianto di microarray presso un'università o una società. La qualità dei microarray fabbricazione è uno dei fattori più critici per il successo di un esperimento di microarray. Provate alcuni servizi, se possibile. Idealmente, si potrebbe stampare 50-100 diapositive alla volta, e tutte le diapositive sarà identico, con ben separate, i punti individuali. Per il supporto microarray,…

Discussion

Nonostante i recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento profondo, microarray rimane una scelta praticabile per high-throughput analisi del DNA e RNA. Rispetto al sequenziamento profondo, gli esperimenti microarray sono più economici, e un laboratorio di biologia molecolare tipico in grado di eseguire la maggior parte degli esperimenti e analisi dei dati in-house, che consente flessibilità e consente di risparmiare tempo. In futuro, microarray probabilmente adatto a interrogare intensamente insiemi di geni, p…

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent