사용자 정의 MicroRNA의 Microarray 실험을 수행
Summary
사용자 정의 microRNA의 microarray 실험을 수행 간단한 절차 설명합니다. 단계, RNA, RNA 라벨링 및 참조 DNA를 분리 microarrays에 샘플을 hybridizing, microarrays를 검색, quantifying 및 하이브리드화 신호를 분석 등이 있습니다.
Abstract
microRNAs는 (miRNAs) 널리 eukaryotes 1 표현됩니다 ~ 22 세포핵 (NT) 긴 RNA 분자의 큰 가족입니다. 복잡한 genomes는 주로 사후 transcriptionally 대상 유전자 2, 3의 방대한 숫자의 표현을 억제 miRNAs 중 적어도 수백, 인코딩. miRNAs는 생물 학적 과정 1 광범위한 제어합니다. 또한, 변경 miRNA 발현이 같은 암 등 인간의 질병와 관련된되었으며, miRNAs는 질병 및 예후 (豫后) 4, 5에 대한 생체 역할을 수 있습니다. 그것은 표현과 여러 가지 조건에서 miRNAs의 기능을 이해하기 위해, 따라서, 중요합니다.
실시간 PCR, microarray, 깊이 시퀀싱 : 세 가지 주요 방법은 프로필 miRNA 발현에 고용되었습니다. miRNA의 microarray의 기술은 일반적으로 저렴 높은 처리량되는 장점을 가지고 있으며, 실험 및 분석 단계의 대부분은 카 수 있습니다대부분의 대학, 의과 대학 및 관련 병원에서 분자 생물학 연구실에서 지휘를 맡는. 여기, 우리는 사용자 정의 miRNA의 microarray 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. miRNA 프로브 세트는 miRNA의 microarrays를 만들어 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. RNA는 작은 RNA 수종을 보존하는 방법이나 시약을 사용하여 절연하고 형광 염료와 함께 표시됩니다. 컨트롤로서, miRNAs의 하위 집합에 해당 참조의 DNA oligonucleotides는 다른 형광 염료로 분류됩니다. 참조 DNA는 슬라이드와 하이브 리다이 제이션의 품질을 증명하기 위해 제공되며, 또한 데이터 정규화에 사용됩니다. RNA와 DNA가 혼합하여 데이터베이스에있는 miRNAs 대부분의 프로브를 포함하는 microarray 슬라이드에 hybridized입니다. 세탁 후, 슬라이드 이미지를 얻기 위해 스캔하고, 개별 명소의 농도는 계량입니다. 이러한 원시 신호는 추가로 처리하고 해당 miRNAs의 표현 데이터로 분석됩니다. Microarray 슬라이드는 옷을 벗긴 채 microarrays의 비용을 절감하고 microarray 실험의 일관성을 향상시키기 위해 생성하실 수 있습니다. 동일한 원칙과 절차를 정의 microarray 실험의 다른 유형에 적용됩니다.
Protocol
Discussion
깊은 시퀀싱 기술의 최근 발전에도 불구하고, microarray는 DNA와 RNA의 높은 처리량 분석을위한 가능한 선택 남아있다. 깊은 시퀀싱에 비해 microarray 실험은 저렴하고 있으며, 전형적인 분자 생물학 연구소의 실험과 유연성을 허용하고 시간을 절약할 수 데이터 분석 사내의 대부분을 수행할 수 있습니다. 앞으로, microarrays 가능성이 적합 집중적으로 유전자, 예를 들어 세트를 심문하러 있으며, 전부 또?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작품은 약물 남용 센터 국립 연구소 (P50 DA 011806)와 국방의 미국 육군과 (W81XWH – 07 – 1-0183)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
References
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