Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК
Summary
Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибридизации сигналов.
Abstract
микроРНК (миРНК) являются большой семье ~ 22 нуклеотидов (нт) длинные молекулы РНК, которые широко выражено у эукариот 1. Комплекс генома кодируют по меньшей мере сотни микроРНК, которые в первую очередь ингибирует экспрессию большого числа генов-мишеней после транскрипционно 2, 3. микроРНК контроль широкий спектр биологических процессов 1. Кроме того, изменения выражения микроРНК была связана с человеческими болезнями, такими как рак, и микро-РНК могут служить в качестве биомаркеров заболеваний и прогноз 4, 5. Важно, таким образом, чтобы понять выражения и функции микроРНК под различными условиями.
Три основные подходы были использованы в профиль микроРНК выражение: ПЦР в реальном времени, микрочипов, и глубокие секвенирования. Техника микроРНК микрочипов имеет преимущество в том, высокую пропускную способность, как правило, менее дорогие, и большинство экспериментальных и анализ шаги могут быть Каррсамодельное взрывное устройство в лаборатории молекулярной биологии в большинстве университетов, медицинских школ и связанные с ними больницы. Здесь мы опишем метод для выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК. Набор микроРНК зонд будет напечатан на предметные стекла для производства микрочипов микроРНК. РНК выделяли с использованием метода или реагент, который сохраняет мелкие виды РНК, а затем помечены флуоресцентным красителем. В качестве контроля ссылкой ДНК олигонуклеотидов соответствующее подмножество микроРНК также помечены различными флуоресценции красителя. Ссылка ДНК будет служить, чтобы продемонстрировать качество слайдов и гибридизации, а также будут использованы для нормализации данных. РНК и ДНК смешивают и гибридизации с микрочипов слайд, содержащий зонды для большинства из микроРНК в базе данных. После мытья слайд сканируется для получения изображения, и интенсивности отдельных пятен количественно. Эти сигналы сырья будут дополнительно обработаны и проанализированы как выражение данные соответствующего микроРНК. МкАrray слайды могут быть удалены и регенерируется снизить стоимость микрочипов и повысить согласованность микрочипов экспериментов. Те же самые принципы и процедуры применимы к другим типам пользовательских экспериментов микрочипов.
Protocol
Discussion
Несмотря на последние достижения в области технологий глубокой последовательности, микрочипов остается жизнеспособным выбором для высокопроизводительного анализа ДНК и РНК. По сравнению с глубоким последовательности, микрочипов эксперименты дешевле, а типичные лаборатории молеку?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при частичной поддержке Национального института наркомании центр (P50 DA 011 806) и Соединенных Штатов армии Министерства обороны (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
References
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
