Utföra Custom Experiment MikroRNA Microarray
Summary
En enkel procedur för att utföra egna experiment mikroRNA microarray beskrivs. De steg som ingår isolera RNA, märkning RNA och referens-DNA, hybridisering proverna till mikroarrayer, skannar microarrays, kvantifiera och analysera hybridisering signaler.
Abstract
mikroRNA (miRNA) är en stor familj av ~ 22 nukleotider (NT) långa RNA-molekyler som ofta uttrycks i eukaryoter 1. Komplexa arvsmassa kodar minst hundratals miRNA, som främst hämmar uttrycket av ett stort antal mål gener efter transkriptionellt 2, 3. miRNA styra ett brett utbud av biologiska processer 1. Dessutom har förändrat miRNA uttryck har associerats med mänskliga sjukdomar såsom cancer, och miRNA kan fungera som biomarkörer för sjukdomar och prognos 4, 5. Det är därför viktigt att förstå uttryck och funktioner miRNA under många olika förhållanden.
Tre viktiga metoder har använts för att profilera miRNA uttryck: realtids-PCR, microarray, och djupa sekvensering. Tekniken att miRNA microarray har fördelen av att vara hög genomströmning i allmänhet billigare, och de flesta av de experimentella och analys steg kan CarrIED i en molekylärbiologiska laboratoriet vid de flesta universitet, medicinska skolor och tillhörande sjukhus. Här beskriver vi en metod för att utföra egna experiment miRNA microarray. En miRNA sond som ska skrivas ut på objektglas för att producera miRNA mikroarrayer. RNA är isolerad med hjälp av en metod eller reagens som bevarar små RNA-arter, och sedan märkt med fluorescens färgämne. Som en kontroll, är referens-DNA oligonukleotider motsvarar en delmängd av miRNA också märkt med en annan fluorescens färgämne. Hänvisningen DNA kommer att visa kvaliteten på bild och hybridisering och kommer också att användas för data normalisering. RNA och DNA blandas och hybridiseras till en microarray bild med sonder för de flesta av miRNA i databasen. Efter tvätt är bilden skannas för att få bilder och intensiteten hos enskilda platser kvantifieras. Dessa råa signaler kommer att ytterligare bearbetas och analyseras som ett uttryck uppgifter i motsvarande miRNA. Microarray diabilder kan avlägsnas och regenereras för att minska kostnaderna för microarrays och öka samstämmigheten i microarray experiment. Samma principer och förfaranden som gäller för andra typer av anpassade microarray experiment.
Protocol
Discussion
Trots den senaste tidens framsteg i djup sekvenseringsteknologier förblir microarray ett lönsamt val för high-throughput analyser av DNA och RNA. Jämfört med djupa sekvensering, microarray experiment är billigare, och en typisk molekylärbiologiska laboratoriet kan utföra de flesta av de experiment och dataanalys i egen regi, som möjliggör flexibilitet och sparar tid. I framtiden mikroarrayer sannolikt väl lämpade för intensivt förhöra uppsättningar gener, t ex kan hela eller en delmängd av transkription…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes delvis av National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011.806) och USA: s armé Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
References
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
