En enkel prosedyre å utføre tilpassede mikroRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinnene omfatter isolere RNA, merking RNA og referanse DNA, hybridizing prøvene til microarrays, skanning microarrays, kvantifisere og analysere hybridisering signaler.
microRNAs (miRNAs) er en stor familie med ~ 22 nukleotider (nt) lang RNA-molekyler som er mye uttrykt i eukaryoter 1. Komplekse genomer kode minst hundrevis av miRNAs, som primært hemmer uttrykk for et stort antall mål gener post-transcriptionally 2, 3. miRNAs kontrollerer et bredt spekter av biologiske prosesser 1. I tillegg har endret miRNA uttrykk vært forbundet med menneskelige sykdommer som kreft, og miRNAs kan tjene som biomarkører for sykdom og prognose 4, 5. Det er derfor viktig å forstå uttrykk og funksjoner miRNAs under mange forskjellige forhold.
Tre store tilnærminger har vært ansatt til profilen miRNA uttrykk: real-time PCR, mikromatriser, og dype sekvensering. Teknikken av miRNA microarray har fordelen av å være high-throughput, generelt mindre kostbare, og det meste av det eksperimentelle og analyse skritt kan være CarrIED ut i en molekylærbiologisk laboratorium ved de fleste universiteter, medisinske skoler og tilhørende sykehus. Her beskriver vi en metode for å utføre tilpassede miRNA microarray eksperimenter. Et miRNA probe settet vil bli trykket på glass lysbilder å produsere miRNA mikromatriser. RNA er isolert ved hjelp av en metode eller reagens som bevarer små RNA arter, og deretter merket med fluorescens fargestoff. Som en kontroll, er referanse DNA-oligonukleotider tilsvarende en undergruppe av miRNAs også merket med en annen fluorescens fargestoff. Henvisningen DNA vil tjene til å demonstrere kvaliteten av rasgropa og hybridisering og vil også bli brukt for data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridisert til en microarray skyve inneholder prober for det meste av miRNAs i databasen. Etter vask, er lysbildet skannes å få bilder, og intensiteter av de enkelte stedene tallfestet. Disse rå signalene vil bli videre bearbeidet og analysert som uttrykk data av tilsvarende miRNAs. Microarray lysbilder kan være strippet og regenereres for å redusere kostnadene ved mikromatriser og å forbedre konsistensen av microarray eksperimenter. De samme prinsipper og prosedyrer som gjelder for andre typer tilpassede microarray eksperimenter.
Til tross for nylige fremskritt i dyp sekvensering teknologier, forblir mikromatriser en levedyktig valg for high-throughput analyser av DNA og RNA. Sammenlignet med dype sekvensering, mikroarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologi laboratoriet kan utføre de fleste av forsøkene og dataanalyse i huset, noe som gir rom for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden microarrays er trolig godt egnet til intensivt forhøre sett av gener, for eksempel, kan alle eller et delsett av transkripsjonsfaktorer…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011 806) og United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).
Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
BlueFuse | BlueGenome | ||
GeneSpring | Agilent |