Utføre Custom mikroRNA Microarray Experiments

Summary

En enkel prosedyre å utføre tilpassede mikroRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinnene omfatter isolere RNA, merking RNA og referanse DNA, hybridizing prøvene til microarrays, skanning microarrays, kvantifisere og analysere hybridisering signaler.

Abstract

microRNAs (miRNAs) er en stor familie med ~ 22 nukleotider (nt) lang RNA-molekyler som er mye uttrykt i eukaryoter ^1. Komplekse genomer kode minst hundrevis av miRNAs, som primært hemmer uttrykk for et stort antall mål gener post-transcriptionally ^{2, 3.} miRNAs kontrollerer et bredt spekter av biologiske prosesser ^1. I tillegg har endret miRNA uttrykk vært forbundet med menneskelige sykdommer som kreft, og miRNAs kan tjene som biomarkører for sykdom og prognose ^{4, 5.} Det er derfor viktig å forstå uttrykk og funksjoner miRNAs under mange forskjellige forhold.

Tre store tilnærminger har vært ansatt til profilen miRNA uttrykk: real-time PCR, mikromatriser, og dype sekvensering. Teknikken av miRNA microarray har fordelen av å være high-throughput, generelt mindre kostbare, og det meste av det eksperimentelle og analyse skritt kan være CarrIED ut i en molekylærbiologisk laboratorium ved de fleste universiteter, medisinske skoler og tilhørende sykehus. Her beskriver vi en metode for å utføre tilpassede miRNA microarray eksperimenter. Et miRNA probe settet vil bli trykket på glass lysbilder å produsere miRNA mikromatriser. RNA er isolert ved hjelp av en metode eller reagens som bevarer små RNA arter, og deretter merket med fluorescens fargestoff. Som en kontroll, er referanse DNA-oligonukleotider tilsvarende en undergruppe av miRNAs også merket med en annen fluorescens fargestoff. Henvisningen DNA vil tjene til å demonstrere kvaliteten av rasgropa og hybridisering og vil også bli brukt for data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridisert til en microarray skyve inneholder prober for det meste av miRNAs i databasen. Etter vask, er lysbildet skannes å få bilder, og intensiteter av de enkelte stedene tallfestet. Disse rå signalene vil bli videre bearbeidet og analysert som uttrykk data av tilsvarende miRNAs. Microarray lysbilder kan være strippet og regenereres for å redusere kostnadene ved mikromatriser og å forbedre konsistensen av microarray eksperimenter. De samme prinsipper og prosedyrer som gjelder for andre typer tilpassede microarray eksperimenter.

Protocol

1. Trykking av tilpassede miRNA microarrays Skriv ut microarray lysbilder hjelp av microarray kjernen Facility Services ved et universitet eller en bedrift. Kvaliteten på microarray fabrikasjon er en av de mest kritiske faktorene for å lykkes med en microarray eksperiment. Prøv noen tjenester dersom mulig. Ideelt sett ville man print 50-100 lysbilder om gangen, og alle lysbildene vil se identiske, med godt atskilt, individuelle flekker. For microarray støtte, bruker vi de hullene II belagt lysbi…

Discussion

Til tross for nylige fremskritt i dyp sekvensering teknologier, forblir mikromatriser en levedyktig valg for high-throughput analyser av DNA og RNA. Sammenlignet med dype sekvensering, mikroarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologi laboratoriet kan utføre de fleste av forsøkene og dataanalyse i huset, noe som gir rom for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden microarrays er trolig godt egnet til intensivt forhøre sett av gener, for eksempel, kan alle eller et delsett av transkripsjonsfaktorer…

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent