目标ID图书馆是一个基于质粒,用于识别miRNA靶基因的克隆基因的全基因组的集合。在这里,我们展示它的使用和应用。
目标ID库的设计,以协助发现和鉴定的microRNA(miRNA)的目标。目标ID图书馆是一个基于质粒的全基因组cDNA文库中克隆到双选zeocin胸苷激酶(TKzeo)融合蛋白,3'UTR下游。第一轮的选择是稳定的转化,引进miRNA的利益,最后,选择的cDNA包含的miRNA的目标。确定选定的cDNA序列(目标ID图书馆的工作流程和细节,请参阅图1-3)。
人类转录,以确保覆盖面广,目标编号图书馆的cDNA产生寡-dT通过使用准备从多种人体组织和细胞系的总RNA池启动。造成cDNA的范围从0.5到4 KB,一个1.2 kb的平均规模,并克隆到的p3TKzeo双选质粒(质粒图谱见图4)。在李代表的目标基因brary Sigma-Aldrich公司的网页上可以找到。 ( 见表3),Illumina的测序结果表明,该库包含16922 21518在UCSC的RefGene独特的基因(79%),或14,000 10或更多的内容(66%)的基因。
microRNA是20-24核苷酸的RNA调节基因表达的转录后通过抑制mRNA的翻译,经常动摇的目标mRNA(综述[6])。单个的miRNA可以调节数百个基因来控制细胞的发展和环境信号的响应。识别和验证目标基因是决定一个miRNA在这些途径中的作用和功能是必不可少的。然而,目标识别,因为在动物中,miRNA和其目标网站不完全互补的,并不是一件简单的。 “种子”的地区,基地通过7 miRNA的5'-端,通常是互补的目标。不过,也有许多例外的种子规则,和下游的碱基配对可以弥补不完善的种子比赛。已开发的计算机算法来预测种子匹配和下游的补偿,目标结构上的miRNA靶D的位置,序列保守性,以及各种实验验证目标(综述[7])已观察到的其他参数。而在硅片的预测是方便做识别许多有效的miRNA靶基因,预测基因实验验证测试失败,许多实际的目标是不预测。此外,由于计算机算法根据先前确定的目标功能,他们根本不容许什么是已知的偏离目标的发现。
一些实验系统已成功地用于识别或发现在活细胞功能的miRNA靶基因。这些全球性的筛查方法包括微阵列和RNA测序,RNA的免疫共沉淀(RIP)和氨基酸在细胞培养稳定同位素标记(SILAC的),蛋白质的方法(综述[7])。每种方法都有优点和缺点。由于miRNA的目标往往破坏的mRNA,并导致其降解,损失ØR GAIN后引进的miRNA模仿或抑制剂,分别在mRNA水平,可以识别miRNA靶标。很容易被检测芯片或深度测序表达这方面的损失或收益。虽然mRNA的检测方法是蛋白检测方法相比更简单,更敏感,基因检测将错过任何miRNA的目标是没有退化。从巴特尔实验室SILAC的那些miRNA靶RNA检测结果比较从最近的报告[8]或核糖体分析[9]表明,哺乳动物的miRNA主要采取行动,减少目标mRNA水平。然而,许多其他实验室工作与个人的miRNA靶基因检测中蛋白质的变化,但在mRNA水平没有变化。什么似乎是没有检测到mRNA的损失与翻译调控的报告包括:miR-10B的上HOXD10 [10],miR221/222上p27kip1的[11]中,miR-21 PDCD4 [12],miR-126的p85β[13]中,miR-34对SIRT1的[14],miR-21的PTEN [15]中,miR-302D Arid4b [16],miR-200C的JAG1 [17],和miR-299,297,567,ND VEGFA 609 [18]。此外,克兰西等[19]最近报道,let-7的翻译调控只发现当包含let-7的目标网站的个人表达亚型选择性检测。后者表明,至少在某些情况下,翻译调控可能被忽略在复合型材 – 也就是说,当所有的mRNA异构体作为一个mRNA的检测 – 与许多芯片和序列分析获得。通过Argonaute蛋白(通常AGO2)或其他相关蛋白(RNA免疫沉淀,或RIP)的miRNA-mRNA的复合物的免疫共沉淀分离miRNA靶基因调控机制。此外,RIP检测内源性的,想必生物学相关,相互作用。但是,不知道是否所有的miRNA-mRNA的相互作用功能,RIP会错过任何mRNA的目标关联只是短暂的,或者是正在迅速退化。此外,特定的miRNA-mRNA的伙伴必须推断bioinformati的美云,因为所有的miRNA表达对共沉淀一起。最后,SILAC的直接识别miRNA调控,蛋白质本身的最终产品,但不敏感,因此错过难得的蛋白质和蛋白水平的小折变化。
鉴于当前miRNA的目标识别方法的局限性,我们认为需要一个附加的全局分析,识别功能miRNA靶基因的一种替代机制。为了满足这种需要,我们许可由JOOP Gaken伦敦大学国王学院和阿齐姆Mohamedali发明的技术。他们的发明是一个双选择融合蛋白,特别是一个胸苷激酶zeocin融合的,在其3'UTR潜在的miRNA靶序列的cDNA文库由监管。可以选择与表达基因TKzeo,结构稳定转染细胞与zeocin,在图2所示。 miRNA的表达了兴趣后,可以选择的miRNA的目标无线网络日更昔洛韦,在图3所示。更昔洛韦杀死细胞表达胸苷激酶,也就是说,任何细胞表达TKzeo的基因缺乏利益的miRNA的目标。有针对性的基因可以分离的DNA的PCR扩增细胞的生存更昔洛韦使用侧翼的cDNA和PCR产品可引物测序,以确定目标。
我们已经发展成为一个全球性的鉴定和功能的人类miRNA靶基因的发现,新工具的国王学院的技术 – 任务目标ID图书馆。与目标识别库,用户可以通过一系列哺乳动物细胞培养转染和药物筛选的步骤隔离miRNA靶基因。图书馆是全面的,包含66-79%的人类基因。初步结果表明,先前发现以及新的目标,可以从任务目标ID图书馆隔离。
虽然该协议是一些长度,目标ID库需要使用标准的分子实验室技术 – 哺乳动物细胞培养,转染,药物筛选,PCR扩增,测序 – 因此,应该在大多数生物学家的手段。我们建议支付足够的重视,适当的实验设计,优化培养条件,最重要的是,预先测试每一个新的细胞类型选择步骤(杀死曲线)与目标识别库,以确保成功,以确定最佳的药物浓度。
与所有的miRNA目标识别方法,它强烈建议用第二种方法,如芯片,定量RT-PCR,记者法(即荧光素酶),或西方的分析,验证,筛选目标ID图书馆确定的目标。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢她的支持和参与丰硕的故障排除讨论整个西格玛生命科学任务目标的ID库的开发团队,尤其是凯文为寻找技术和谈判授权条款Gutshall,希瑟Holemon的。我们也感谢伦敦大学国王学院的博士JOOPGäken自由分享它克隆的cDNA伟大的批次和他坚持准备在未发表的结果和建议,和RxBiosciences哈米德·卡齐。我们想南邻和斯科特·巴哈尔承认SAFC进行cDNA阵列和数据分析。
任务是Sigma-Aldrich公司的生物技术LP的注册商标。
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |