Библиотека Target ID является плазмида основе, генома коллекции клонированных кДНК используется для идентификации микроРНК целей. Здесь мы показываем его использования и применения.
Библиотека Target ID предназначен для оказания помощи в открытии и идентификации микроРНК (миРНК) целей. Библиотека Target ID является плазмида основе, генома библиотеки кДНК клонировали в 3'UTR вниз по течению от двойного отбора гибридного белка, тимидинкиназы-zeocin (TKzeo). Первый раунд отбора для стабильного трансформантов, а затем с введением микроРНК интерес, и, наконец, выбрать для кДНК содержащих цель в микроРНК. Выбранный кДНК определяются последовательности (см. Рисунок 1-3 для Target ID Workflow Библиотеки и детали).
Для обеспечения широкого охвата человека транскриптом, Target ID библиотеки кДНК были получены с помощью олиго-дТ грунтовки использованием пула тотальной РНК готовят из нескольких человеческих тканей и клеточных линиях. В результате кДНК в диапазоне от 0,5 до 4 кб, со средним размером 1,2 кб, и были клонированы в p3TKzeo двойного выбора плазмид (см. Рисунок 4 карта плазмиды). Ген целей, представленных в лиbrary можно найти на Sigma-Aldrich веб-страницы. Результаты Illumina последовательности (табл. 3) показывают, что библиотека включает в себя 16 922 из 21 518 уникальных генов в УСК RefGene (79%), или 14 000 генов с 10 или более чтения (66%).
микроРНК являются 20-24 нуклеотидных РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипционно путем ингибирования перевод мРНК, и часто, дестабилизации целевой мРНК (см. обзор в [6]). Одной микроРНК могут регулировать несколько сотен мРНК контролировать реакцию клетки на развития и окружающей среды сигналы. Определение и утверждение целевой мРНК имеет важное значение в определении роли микроРНК и функции в этих путей. Тем не менее, цель идентификации не просто потому, что у животных микроРНК и их сайты цель не в полной мере дополняют друг друга. «Семя» региона, строит со 2 по 7 от 5'-конца миРНК, как правило, дополнения к своей цели. Тем не менее, есть много исключений из семян правило, ниже по течению и спариванием оснований может компенсировать несовершенным матч семян. Число компьютерных алгоритмов были разработаны для прогнозирования микроРНК целей на основе соответствия семян и вниз по течению компенсации, целевой структурыг положении, последовательность сохранения, а также различные другие параметры, которые были обнаружены экспериментально подтверждены для целей (см. обзор в [7]). В то время как в кремнии предсказания удобным и сделать выявить многие действительными целями микроРНК, большинство генов предсказал неудачу экспериментальных проверку, и многие фактические цели не прогнозируется. Кроме того, поскольку компьютерные алгоритмы основаны на ранее определенных функций цели, они не позволяют открытие цели, которые отличаются от того, что уже известно.
В ряде экспериментальных систем были успешно использованы для идентификации или обнаружить функциональные цели микроРНК в живых клетках. Эти глобальные методы обследования включают микрочипов и РНК последовательности, РНК совместной иммунопреципитации (RIP), маркировка и стабильный изотоп с аминокислоты в культуре клеток (SILAC), протеомных методов (см. обзор в [7]). Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. С микроРНК ориентации часто дестабилизирует мРНК и приводит к ее деградации, потери оГ выигрыш в уровне мРНК после введения микроРНК имитировать или ингибиторов, соответственно, может идентифицировать микроРНК целей. Эта потеря или приобретение мРНК легко обнаружить микрочипов или глубокой последовательности. Хотя методы обнаружения РНК проще и более чувствительны, чем методы обнаружения белка, мРНК обнаружения пропустите ни микроРНК цели, которые не деградировали. Недавние сообщения из лаборатории Bartell сравнения результатов микроРНК цель от обнаружения РНК с теми, от SILAC [8] или рибосома профилирования [9] показали, что микроРНК млекопитающих преимущественно действуют за счет уменьшения уровня целевой мРНК. Тем не менее, многих других лабораториях, работающих с отдельными целями микроРНК обнаружены изменения белка, но никаких изменений в уровне мРНК. Доклады что, кажется, поступательное регулирование, не обнаруживается потеря мРНК включают в себя: Мир-10b на HOXD10 [10], miR221/222 на p27kip1 [11], Мир-21 на Pdcd4 [12], микроРНК-126 p85β [13] Мир-34 на SIRT1 [14], Мир-21 на PTEN [15], Мир-302d на Arid4b [16], Мир-200С на JAG1 [17], и микроРНК-299, 297, 567,609-й VEGFA [18]. Кроме того, Клэнси и др. [19] недавно сообщили, что поступательное регулирование let-7 была обнаружена только при отдельных изоформ мРНК, которые содержат let-7 целевом сайте были обнаружены выборочно. Последняя предполагает, что, по крайней мере в некоторых случаях, поступательное регулирования могут остаться незамеченными в композитных профилей – то есть, когда все изоформы мРНК обнаружении одной мРНК – как получить со многими микрочипов и последовательность анализа. Со-иммунопреципитации миРНК-мРНК комплексов через Argonaute (обычно ago2) или другой связанный белок (РНК иммунопреципитации или RIP) будет изолировать миРНК цели независимо от того, механизм регулирования. Кроме того, RIP определяет эндогенные, и, предположительно, биологически значимым, взаимодействий. Тем не менее, не известно, все ли микроРНК-мРНК взаимодействия функциональных и RIP будет не хватать любой мРНК целей, которые связывают только временно или быстро деградирует. Кроме того, в конкретных миРНК-мРНК партнеры должны быть выведены bioinformatiски, потому что все миРНК-мРНК пар со-осаждается вместе. Наконец, SILAC непосредственно определяет конечный продукт микроРНК регулирования, самого белка, но без учета регистра, и поэтому пропускает редкие белки и небольшие раз изменения уровня белка.
В свете ограничения современных методов идентификации микроРНК цель, мы чувствовали себя дополнительные глобального анализа для выявления функциональных целей микроРНК на альтернативный механизм было необходимо. Чтобы выполнить эту задачу, мы лицензировали технологии изобретены Joop Gaken и Азим Mohamedali из Королевского колледжа в Лондоне. Их изобретение является двойной гибридного белка выбор, в частности, тимидинкиназы-zeocin синтеза, регулируются библиотеки кДНК потенциальных микроРНК целевой последовательности в 3'UTR. Клетки стабильно трансфицированных и выражая TKzeo-кДНК конструкциями могут быть выбраны с zeocin, как показано на рисунке 2. После выражения микроРНК интересов, целей, микроРНК может быть выбран шм ганцикловир, как показано на рисунке 3. Ганцикловир убивает клетки, экспрессирующие тимидинкиназы, то есть любой клетки, экспрессирующие TKzeo-кДНК отсутствует мишень для микроРНК интерес. Целевые кДНК могут быть выделены путем ПЦР-амплификации ДНК из клеток, которые выживают ганцикловиром с использованием праймеров, что фланг кДНК и ПЦР-продукты могут быть упорядочены для определения целей.
Мы разработали технологию колледже короля в новый инструмент для глобальной идентификации и обнаружения человека функциональных целей микроРНК – ID МИССИЯ целевой библиотеки. В библиотеке ID Target, пользователи могут изолировать миРНК цели рядом млекопитающих трансфекции клеточных культур и меры выбор препарата. Библиотека носит комплексный характер и содержит 66-79% генов человека. Первые результаты показывают, что как ранее открытых, так и новые цели могут быть выделены из библиотеки ID целевой МИССИИ.
Хотя протокол некоторой длины,использование библиотеки ID целевой требует стандартных способов молекулярной лаборатории – культуры клеток млекопитающих, трансфекция, выбор препарата, ПЦР и секвенирования – и, следовательно, должна быть в пределах средств большинство биологов. Мы полагаем, что достаточно внимания уделять надлежащее опытно-конструкторских, оптимизации условий культивирования, а главное, предварительное тестирование каждого нового типа клеток, чтобы определить оптимальный уровень препарата для выбора шагов (kill-кривые), чтобы обеспечить успех с библиотекой ID цели.
Как и во всех микроРНК методы опознавания цели, настоятельно рекомендуется, чтобы цели, определенные путем скрининга библиотеки Target ID быть проверены с помощью второго метода, такие, как микрочипы, QRT-PCR, репортер анализа (например, люциферазы), или западные анализа.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всю жизнь Sigma наук Миссия Target ID библиотеки разработчиков, особенно Кевин Gutshall нахождения технологии и переговоры условиями лицензии, и Хизер Holemon за ее поддержку и участие в плодотворных дискуссий неисправностей. Мы также благодарим доктора Joop Gäken из Королевского колледжа в Лондоне для свободного обмена неопубликованные результаты и предложения, и Кази Хамид из RxBiosciences для подготовки большой партии кДНК и его настойчивость в получении его клонировать. Мы хотели бы выразить признательность Нань Линь и Скотт Бахр от SAFC для выполнения кДНК массивов и анализа данных.
Миссия является зарегистрированным товарным знаком Sigma-Aldrich биотехнологии LP
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |