ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.
ספריית מזהה יעד נועד לסייע מטרות גילוי וזיהוי של microRNA (מירנה). ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו ספריית cDNA משובטים לתוך הזרם 3'UTR של חלבון מבחר כפול היתוך, תימידין קינאז-zeocin (TKzeo). הסיבוב הראשון של הברירה היא transformants יציבות, ואחריו עם הקדמה של מירנה עניין, ובסופו של דבר, בחירה עבור cDNAs המכילים היעד של מירנה. CDNAs נבחרים מזוהים על ידי רצף (ראה איור 1-3 עבור זרימת עבודה מזהה ספריית היעד לפרטים נוספים).
כדי להבטיח כיסוי רחב של transcriptome האנושי, יעד מזהה ספריית cDNAs נוצרו באמצעות תחול oligo-DT באמצעות מאגר של RNA הכל מוכן מרקמות אדם מספר רב של שורות תאים. וכתוצאה מכך מגוון cDNA מ 0.5 עד 4 קילו, עם גודל ממוצע של 1.2 קילו, והיו משובטים לתוך כפול מבחר p3TKzeo פלסמיד (ראה איור 4 על מפת הפלסמיד). הגן מטרות המיוצגות library ניתן למצוא באתר האינטרנט Sigma-Aldrich. תוצאות Illumina רצף (לוח 3), עולה כי הספרייה כולל 16,922 של 21,518 גנים ייחודיים UCSC RefGene (79%), או 14,000 גנים עם 10 או יותר קורא (66%).
מיקרו RNA הם 20-24 RNAs נוקלאוטיד המווסתים ביטוי גנים לאחר תעתיק של התרגום מעכב mRNA, ולעתים קרובות, ערעור היציבות mRNA ממוקד (בדיקה ב [6]). מירנה אחד יכול לווסת כמה מאות mRNAs לשלוט התגובה של התא אותות התפתחותיים וסביבתיים. זיהוי ואימות mRNAs יעד הכרחי בקביעת התפקיד של מירנה ותפקוד במסלולים אלה. עם זאת, זיהוי המטרה היא לא פשוטה, כי אצל בעלי חיים, miRNAs ואתרי היעד שלהם הם לא משלים באופן מלא. "הזרע" באזור, מבסס 2 עד 7 מסוף 5'-של מירנה, הוא בדרך כלל משלים מטרותיו. עם זאת, יש הרבה יוצאים מן הכלל זרע, במורד בסיס ההתאמה יכול לפצות על התאמה מושלמת זרע. מספר אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה על בסיס התאמה זרע ופיצוי במורד הזרם, מבנה היעדעמדת D, שימור הרצף, ופרמטרים נוספים שונים נצפו על מטרות תוקף הניסוי (בדיקה ב [7]). בעוד סיליקו תחזיות נוח ולעשות רבות לזהות מטרות מירנה חוקיים, רובם חזו גנים להיכשל בדיקות אימות ניסיוני, ויעדים בפועל רבים אינם חזה. יתר על כן, מאז אלגוריתמים מבוססים על תכונות היעד שנקבעו קודם לכן, הם אינם מאפשרים גילוי של מטרות החורגות ממה שכבר ידוע.
מספר מערכות ניסיוניות שימשו בהצלחה לזהות או לגלות מטרות תפקודיות מירנה בתאים חיים. אלה שיטות ההקרנה גלובליים כוללים microarrays ו-RNA רצף, RNA שיתוף immunoprecipitation (RIP), וסימון איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC), שיטה proteomic (בדיקה ב [7]). לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. מאז מירנה מיקוד לעתים קרובות מערערת mRNA מוביל לזילות שלו, אובדן oרווח R ברמת mRNA לאחר החדרת מירנה לחקות או מעכב, בהתאמה, יכול לזהות מטרות מירנה. הפסד זה או רווח של mRNA מזוהה בקלות על ידי microarray או רצף עמוק. תוך גילוי שיטות mRNA הם פשוט רגישים יותר מאשר שיטות זיהוי חלבונים, זיהוי ה-mRNA יחמיץ שום מטרות מירנה שאינם מפורקים. דיווחים אחרונים של המעבדה Bartell השוואת יעד תוצאות מירנה מ איתור RNA עם אלה SILAC [8] או פרופיל הריבוזום [9] מצביעים על כך miRNAs יונקים בעיקר לפעול על ידי הפחתת רמות ה-mRNA המטרה. עם זאת, מעבדות רבים אחרים העובדים עם מטרות מירנה בודדים לא זוהה שינוי בחלבון אך לא חל שינוי ברמת ה-mRNA. דיווחים על מה שנראה תקנה translational ללא אובדן mRNA לגילוי כוללים: miR-10b על HOXD10 [10], miR221/222 על p27kip1 [11], miR-21 על Pdcd4 [12], miR-126 על p85β [13] , miR-34 על SIRT1 [14], miR-21 על PTEN [15], miR-302d על Arid4b [16], miR-200C על JAG1 [17], ו miR-299, 297, 567,nd 609 על VEGFA [18]. יתר על כן, קלנסי ואח' [19] לאחרונה דווח כי תקנה translational ידי בואו-7 התגלתה רק כאשר isoforms mRNA בודדים המכילים את האתר בואו-7 היעד התגלו באופן סלקטיבי. זה האחרון מצביע על כך, לפחות בחלק מהמקרים, רגולציה translational ניתן להתעלם בפרופיל מרוכבים – כלומר, כאשר כל isoforms mRNA מזוהים כמו mRNA 1 – כפי שנתקבל עם microarray רבים וניתוחים ברצף. שיתוף immunoprecipitation של מירנה-mRNA באמצעות מתחמי argonaute (בדרך כלל ago2) או חלבון אחר הקשור (RNA immunoprecipitation, או RIP) יהיה לבודד את מטרות מירנה ללא קשר מנגנון ויסות. בנוסף, RIP מזהה אנדוגני, ומן הסתם רלוונטי מבחינה ביולוגית, אינטראקציות. עם זאת, לא ידוע אם כל מירנה-mRNA אינטראקציות הם פונקציונליים, ולקרוע יחמיץ שום מטרות mRNA כי מקשרים רק זמני או מפורקים במהירות. יתר על כן, ספציפיים מירנה-mRNA שותפים יש להסיק bioinformatiקאלי משום שכל מירנה-mRNA זוגות שיתוף זירז יחד. לבסוף, SILAC ישירות מזהה את המוצר הסופי של התקנה מירנה, החלבון עצמו, אבל הוא לא רגיש ועל כן מתגעגע חלבונים נדירים ושינויים לקפל קטנים רמות החלבון.
לאור המגבלות הנוכחיות עם מירנה היעד שיטות הזיהוי, הרגשנו assay גלובלית נוספת כדי לזהות מטרות מירנה תפקודית על ידי מנגנון חלופי היה צורך. כדי למלא את הצורך הזה, אנחנו רישיון טכנולוגיה שהומצאה על ידי יופ Gaken ו עזים Mohamedali של לונדון בקינגס קולג'. ההמצאה שלהם הוא חלבון כפול היתוך הבחירה, באופן ספציפי, שילוב kinase-zeocin תימידין, מוסדר על ידי ספריית cDNA של פוטנציאל היעד רצפים מירנה ב 3'UTR שלה. תאים transfected ביציבות עם ולבטא TKzeo-cDNA בונה ניתן לבחור עם zeocin, כפי שמודגם באיור 2. לאחר הבעת עניין מירנה, מטרות של מירנה ניתן לבחור אינטרנטganciclovir ה, כפי שמודגם באיור 3. Ganciclovir הורג תאים להביע תימידין קינאז, כלומר, כל התאים לבטא TKzeo-cDNA חסר מטרה מירנה של עניין. ממוקד cDNA יכול להיות מבודד על ידי הגברה PCR של ה-DNA של תאים ששורדים primers באמצעות ganciclovir כי האגף מוצרים cDNA ו PCR יכול להיות רצף לזהות מטרות.
פיתחנו טכנולוגיה במכללת המלך לתוך כלי חדש לזיהוי הגילוי העולמי של מטרות תפקודיות מירנה אדם – יעד המשימה ספריית מזהה. עם הספרייה מזהה מטרה, משתמשים יכולים לבודד את מטרות מירנה על ידי שורה של transfection התרבות יונקים התא ובחירת צעדים סמים. הספרייה היא מקיפה, והוא מכיל 66-79% מכלל הגנים האנושיים. תוצאות ראשוניות מצביעות על כך גם גילה בעבר, כמו גם מטרות חדשות יכול להיות מבודד ספריית יעד המשימה מזהה.
אף על פי הפרוטוקול הוא באורך כלשהו,שימוש בספריית מזהה יעד מחייב תקן טכניקות מעבדה מולקולרית – תרבית תאים transfection יונקים,, בחירת התרופה, PCR, וסדר – ולכן, צריך להיות גם במסגרת האמצעים של רוב הביולוגים. אנו מציעים תשומת לב מספקת ישולם עיצוב ניסיוני נכונה, אופטימיזציה של תנאי התרבות, והכי חשוב, לפני בדיקה של כל סוג תא חדש כדי לקבוע רמות התרופה האופטימלי עבור צעדים הבחירה (kill של עקומות) כדי להבטיח הצלחה עם ספריית מזהה מטרה.
כמו בכל יעד מירנה שיטות הזיהוי, מומלץ מאוד כי מטרות שזוהו על ידי הקרנת ספריית מזהה מטרה להיות מאומת עם השיטה השנייה, כגון microarray, qRT-PCR, assay הכתב (כלומר, בלוציפראז), או ניתוח המערבי.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים המדע כולו Sigma החיים המשימה יעד מזהה ספריית פיתוח צוות, במיוחד קווין Gutshall למציאת טכנולוגיה משא ומתן תנאי הרשיון, והת'ר Holemon על התמיכה שלה והשתתפות בדיונים לפתרון בעיות פוריות. כמו כן, אנו מודים לד"ר יופ Gäken של לונדון בקינגס קולג' בחופשיות על שיתוף שלא פורסמו התוצאות והצעות ו Qazi חמיד של RxBiosciences להכנת המנה הגדולה של cDNA וההתמדה שלו מקבל את זה משובטים. ברצוננו להודות נאן לין סקוט באהר מ SAFC לביצוע מערכי cDNA וניתוח נתונים.
המשימה הוא סימן מסחרי רשום של Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |