סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי
Summary
אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.
Abstract
הפרוגנוזה הסיווג הנוכחי של CRC מסתמך על היערכות מערכות המשלבים היסטופתולוגיות ממצאים קליניים. עם זאת, ברוב המקרים CRC, תפקוד לקוי של התא היא תוצאה של מוטציות רבים לשנות ביטוי חלבון ופוסט translational שינוי 1.
מספר פני השטח אנטיגנים התא, כולל מקבץ של (CD) אנטיגנים בידול, זוהו סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאליים או גרורתי CRC. אנטיגנים אלה הופכים סמנים אידיאלי כביטוי שלהם לעתים קרובות שינויים עם התקדמות הגידול או אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון גידולים הסתננות לימפוציטים (TILs) לבין גידולים הקשורים מקרופאגים (TAMs).
השימוש אימונוהיסטוכימיה (IHC) לטיפול בסרטן תת סיווג התחזית מבוססת היטב של כמה סוגי גידולים 2,3. עם זאת, לא "סמן" יחיד הוכיח משמעות פרוגנוסטית יותר מאשר הזמני המרפאה-פתולוגי או צבר הסכמה רחבה לשימוש דיווח הפתולוגיה שגרתי בכל המקרים CRC.
גישה האחרונות יותר ריבוד פרוגנוסטיים של המחלה פנוטיפים מסתמך על פני השטח באמצעות חלבון פרופילים מרובים "סמנים". בעוד פרופיל הביטוי של גידולים תוך שימוש בטכניקות proteomic כגון iTRAQ הוא כלי רב עוצמה על גילוי biomarkers4, זה לא אופטימלי לשימוש שגרתי במעבדות אבחון אינה יכולה להבחין סוגי תאים שונים באוכלוסייה מעורבת. בנוסף, כמויות גדולות של רקמת הגידול נדרשים עבור פרופיל של קרום גליקופרוטאינים מטוהרים פלזמה בשיטות אלה.
בסרטון הזה תיארנו שיטה פשוטה אפיון פני השטח של תאים proteome קיימא מן disaggregated דגימות CRC באמצעות microarray CRC DotScan נוגדן. Microarray 122-נוגדן מורכב באזור 82-נוגדן תקן להכיר מגוון של השושלת הסמנים הספציפיים ליקוציט, מולקולות הדבקה, קולטנים סמנים של דלקת התגובה החיסונית 5, יחד עם האזור לווין לגילוי של 40 סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאלי עבור CRC . תאים הם כבשו רק על נוגדנים שהם מבטאים את האנטיגן המתאים. צפיפות התאים לכל נקודה, נקבע על ידי סורק אופטי, משקף את חלקם של התאים לבטא כי אנטיגן, רמת הביטוי של אנטיגן ואת הזיקה של הנוגדן 6.
עבור רקמת רירית המעי CRC או רגיל, סורק אופטי לשקף את immunophenotype של אוכלוסיות מעורבות של תאים. ריבוב Fluorescence לאחר מכן ניתן להשתמש בפרופיל הנבחר תת אוכלוסיות של תאים בעלי עניין שנתפסו על המערך. לדוגמה, 647-Alexa אנטי אפיתל הידבקות התא מולקולות (EpCAM; CD326), הוא אנטיגן הפאן אפיתל בידול ששימש לזהות תאים CRC גם לתאי האפיתל של רירית המעי נורמלי, בעוד Phycoerythrin אנטי-CD3, שימש כדי לזהות חדירה לתאי T-7. CRC DotScan microarray צריך להיות טיפוס אחר חלופה אבחון למערכת CRC אנטומית מבוססי הזמני.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך microarray נוגדן DotScan ניתן להשתמש דרך פשוטה וכמותיות, ללמוד אנטיגן פרופילים השטח עבור אוכלוסיות תאים מרקמות CRC.
קבלת השעיה בת קיימא תא בודד מרקמת הוא קריטי להצלחה של הניסוי, כי האנרגיה תלויה בתהליכים (למשל, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות על מעבדות פתולוגיה אנטומית של הנסיך המלכותי אלפרד חולים קונקורד והרפטריאציה לאיסוף דגימות טריים של CRC ו רירית מעיים רגילה. העבודה מומן על ידי מענק מכון הסרטן בניו דרום ויילס תוכנית Translational.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
