항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일
Summary
그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.
Abstract
CRC의 현재 예측과 분류 histopathologic 및 임상 결과를 통합하는 시스템을 준비에 의존합니다. 그러나, CRC 케이스의 대다수에서, 세포 기능 장애는 단백질 표현과 사후 translational 수정 수정 1 수많은 돌연변이의 결과이다.
차별화 (CD) 항원의 클러스터를 포함하여 세포 표면 항원,의 숫자 CRC 잠재적인 전조 또는 전이성 생체으로 확인되었습니다. 이러한 항원들은 종종 자신의 표현으로 종양의 진행이나 다른 세포 유형, 같은과 상호 작용과 변화를 이상적인 생체를 종양 – 침투 lymphocytes (TILs)와 종양 – 관련 macrophages (리버 탐)를.
암 하위 분류와 예지를위한 immunohistochemistry (IHC)의 사용은 물론 일부 종양 유형 2,3에 대해 설정됩니다. 그러나, 하나의 '표지'는 clinico – 병적인 준비 이상의 전조 중요성을 표시하거나 모든 CRC 케이스의 일상 병리보고에 사용하기 위해 광범위한 수용을 받고있다.
질병 phenotypes의 전조 충화에 더 최근의 접근 방법은 여러 '표시'를 사용하는 표면 단백질 프로파일에 의존합니다. 같은 iTRAQ로 proteomic 기술을 이용하여 종양의 표현 프로 파일링이 biomarkers4의 발견을위한 강력한 도구이지만, 그것은 진단 실험실에서 일상적인 사용을위한 최적되지 않고 혼합 인구의 서로 다른 세포 유형을 구분할 수 없습니다. 또한, 종양 조직의 대량는 이러한 방법으로 정화 플라즈마 막 glycoproteins의 프로파일이 필요합니다.
이 비디오에서 우리는 DotScan CRC의 항체 microarray를 사용하여 disaggregated CRC 샘플에서 가능한 세포의 표면 프로테옴 프로 파일링위한 간단한 방법을 설명했다. 122 – 항체 microarray는 CRC 40 잠재적인 전조 마커의 검출을위한 위성 지역과 함께 혈통 특정 백혈구 마커, 접착 분자, 수용체 및 염증 및 면역 반응 5 마커의 범위를 인식 표준 82 – 항체 영역으로 구성되어 있습니다 . 세포는 그들이 해당 항원을 표현하는 항체에 캡처됩니다. 광학 스캔에 의해 결정 점 당 세포 밀도, 그 항원, 항체 6 항원과 친화력의 표현의 수준을 표현하는 세포의 비율을 반영합니다.
CRC 조직이나 정상적인 창자 점막 들어, 광학 스캔은 세포의 혼합 인구의 immunophenotype을 반영합니다. 형광 멀티플렉싱은 다음 배열에 캡처 관심 세포의 선택된 하위 인구 프로파일에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 알렉사 647 – 안티 상피 세포 유착 분자 (EpCAM, CD326)는 Phycoerythrin – 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어, 사용하는 동안, CRC 세포뿐만 아니라 정상적인 창자 점막의 상피 세포를 감지하는 데 사용한 냄비 – 상피 분화 항원이다 T – 세포 7 침투 감지합니다. DotScan CRC microarray는 해부학적인 몸의 구조 기반 CRC의 준비 시스템 진단 대안에 대한 프로토 타입을해야합니다.
Protocol
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 DotScan 항체 microarray는 CRC 조직의 세포 집단을위한 표면 항원 프로필을 연구하기위한 간단한 세미 양적 방법으로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
에너지 종속 프로세스 (예 : 항원이 상한 및 / 또는 pseudopodia 형성) 보육시 항체 점들에 전체 세포의 회사 바인딩에 필요한 것으로 나타납니다 때문에 조직에서 가능한 단일 세포 현탁액 구하기, 실험의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 로얄 프린스 알프레드와 CRC와 정상적인 장 점막의 신선한 샘플 수집에 대한 콩코드 송환 병원의 해부 병리학 연구소에서 직원을 감사드립니다. 작품은 암 연구소 뉴사우스 웨일즈 Translational 프로그램 권한 부여에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
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