Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing
Summary
Kolorektal kanser (CRC) uygulanabilir tek bir hücre üretmek için, daha sonra yüzey antijenleri (DotScan ÇHS mikroarray) tanıyan özelleştirilmiş antikor mikrodizinlerinde yakalanır ayrıştırılmasıyla için bir prosedür nitelendirdi. Mikroarray bağlı hücrelerin alt popülasyonlarda floresan boya ile monoklonal antikorlar kullanılarak floresans çoklama profilli olabilir.
Abstract
ÇHS geçerli prognoz ve sınıflandırma sistemleri evreleme histopatolojik ve klinik bulgular entegre dayanır. Ancak, ÇHS vakaların çoğunda protein ekspresyonu ve post-translasyonel değişiklik 1 değişiklik sayısız mutasyonlar, hücre disfonksiyonu sonucu.
CRC potansiyel prognostik veya metastatik biyobelirteçleri farklılaşmasını (CD) antijenlerinin küme de dahil olmak üzere hücre yüzey antijenleri, bir dizi olarak tespit edilmiştir. Bu antijenler genellikle kendi ifadesi olarak tümör progresyonu veya diğer hücre türleri gibi ile etkileşim değişiklikleri ideal biyobelirteçleri yapmak tümör infiltre eden lenfositler (TILs) ve tümör ilişkili makrofajlar (TAM).
Kanseri alt sınıflandırma ve prognoz tahmini için immünhistokimyasal (İHK) kullanımı bazı tümör tiplerinde 2,3 için kurulmuştur. Ancak, tek bir 'işaretleyici' den büyük klinik-patolojik prognostik önemi gösterilen veya rutin patoloji raporlama tüm CRC durumlarda kullanılmak üzere geniş bir kabul görmüştür.
Hastalık fenotipleri prognostik tabakalaşma bir daha yeni bir yaklaşım, birden çok 'işaretleyicileri kullanarak yüzey protein profilleri dayanmaktadır. ITRAQ olarak proteomik teknikler kullanarak tümörlerin ifade profil biomarkers4 keşfi için güçlü bir araç olmasına rağmen, teşhis laboratuvarlarında rutin kullanımı için en uygun değildir ve karışık bir nüfus farklı hücre tipleri ayırt edemez. Buna ek olarak, tümör dokusu büyük miktarda bu yöntemlerle saflaştırılmış plazma zarı glikoproteinler profil için gereklidir.
Bu video DotScan CRC antikor mikroarray kullanarak ayrıştırılmış CRC örneklerinden canlı hücreler yüzey proteom profil için basit bir yöntem tanımlanmıştır. 122-antikor mikroarray KRK için 40 potansiyel prognostik belirteçlerin tespiti için bir uydu bölge ile birlikte, bir dizi özel soyundan lökosit belirteçler, adezyon moleküllerinin, reseptörleri ve enflamasyon ve immün yanıt 5 belirteçleri tanıyan standart bir 82-antikor bölgesi oluşur . Hücreler, yalnızca ilgili antijen ifade antikorlar yakalanır. Nokta başına optik tarama tarafından belirlenen hücre yoğunluğu, bu antijen, antijen ve antikor 6 yakınlık ifade düzeyi ifade hücrelerinin oranını yansıtır.
CRC doku ya da normal bağırsak mukoza hücrelerinin karışık nüfusu, optik taramaları immünfenotip yansıtmaktadır. Floresan çoğullama sonra dizi yakalanan ilgi hücreleri seçilen alt popülasyonlarda profil kullanılabilir. Örneğin, Alexa 647 anti-epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM CD326) Fikoeritrin-anti-CD3, kullanılmış iken, CRC hücreleri ve normal bağırsak mukozasında epitel hücreleri algılamak için kullanılan bir pan-epitelyal farklılaşma antijen T-hücrelerinin 7 infiltre algılamak için. DotScan CRC mikroarray anatomik tabanlı CRC evreleme sistemi için bir tanı alternatif prototip olmalıdır.
Protocol
Discussion
Bu video, DotScan antikor mikroarray CRC doku hücre popülasyonlarının için yüzey antijeni profillerini incelemek için basit, yarı-kantitatif bir şekilde nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
İnkübasyon sırasında bütün hücrelerin antikor nokta firma bağlanma için gerekli olan enerji bağımlı süreçler (örn., antijen kapak kapatma ve / veya pseudopodia oluşumu) görünür, çünkü doku yaşayabilir bir tek hücre süspansiyonu elde etme, deneyin başarısı içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Royal Prince Alfred ve Concord ÇHS ve normal bağırsak mukozasında taze örnekleri toplamak için ülkesine geri gönderilme Hastaneler Anatomik Patoloji Laboratuvarları personel teşekkür ederim. Iş Kanser Enstitüsü Yeni Güney Galler Translasyonel Programı Hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
