Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência
Summary
Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.
Abstract
O prognóstico atual e classificação do CRC conta com encenação de sistemas que integram achados histopatológicos e clínicos. No entanto, na maioria dos casos CRC, disfunção das células é o resultado de numerosas mutações que modificam a expressão da proteína e pós-translacionais modificação 1.
Um número de antígenos de superfície celular, incluindo cluster de diferenciação (CD) de antígenos, foram identificados como prognósticos ou potenciais biomarcadores metastático em CRC. Estes antígenos fazer biomarcadores ideal como sua expressão muitas vezes muda com a progressão do tumor ou interações com outros tipos de células, como linfócitos tumor infiltrantes (TILs) e tumor associado macrófagos (TAMs).
O uso da imuno-histoquímica (IHQ) para o câncer de sub-classificação e prognóstico é bem estabelecida para alguns tipos de tumor 2,3. No entanto, não 'marcador' single mostrou significado prognóstico maior do que clínico-patológica de teste ou ganhou ampla aceitação para uso em relatórios de patologia de rotina de todos os casos CRC.
Uma abordagem mais recente para a estratificação prognóstica de fenótipos da doença depende de perfis de proteínas de superfície usando vários "marcadores". Enquanto perfil de expressão de tumores através de técnicas proteômicas como iTRAQ é uma poderosa ferramenta para a descoberta de biomarkers4, não é ideal para uso rotineiro nos laboratórios de diagnóstico e não pode distinguir diferentes tipos de células em uma população mista. Além disso, grandes quantidades de tecido tumoral são necessários para a caracterização de glicoproteínas da membrana plasmática purificada por estes métodos.
Neste vídeo nós descrevemos um método simples para criar perfis de superfície proteoma de células viáveis a partir de amostras desagregadas CRC usando um anticorpo DotScan microarray CRC. O microarray 122-anticorpo consiste em uma região de anticorpos 82-standard reconhecendo uma série de marcadores de linhagem específica de leucócitos, moléculas de adesão, receptores e marcadores de inflamação e resposta imune 5, bem como uma região satélite para a detecção de 40 marcadores potencialmente prognóstico para CRC . Células são capturadas apenas em anticorpos para os quais eles expressam o antígeno correspondente. A densidade de células por ponto, determinado pelo escaneamento óptico, reflete a proporção de células que expressam esse antígeno, o nível de expressão do antígeno e afinidade do anticorpo 6.
CRC de tecido ou mucosa intestinal normal, scans óptica refletem o imunofenótipo de populações mistas de células. Multiplexação de fluorescência pode então ser usada para perfil selecionado sub-populações de células de interesse capturado no array. Por exemplo, Alexa molécula de adesão 647-anti-células epiteliais (EpCAM; CD326), é um antígeno de diferenciação pan-epiteliais que foi usado para detectar células CRC e também células epiteliais da mucosa intestinal normal, enquanto Ficoeritrina-anti-CD3, foi usado para detectar infiltração de células T-7. O CRC DotScan microarray deve ser o protótipo de uma alternativa de diagnóstico para o sistema de estadiamento baseado anatomicamente CRC.
Protocol
Discussion
Neste vídeo, demonstramos como o microarray de anticorpos DotScan pode ser usado em uma forma simples e semi-quantitativa para estudar perfis de antígeno de superfície para as populações de células do tecido CRC.
Obtenção de uma suspensão de células viáveis único a partir do tecido é fundamental para o sucesso do experimento, porque a energia dependente de processos (por exemplo, antígeno de nivelamento e / ou formação de pseudópodos) parecem ser necessárias para a li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a equipe do Laboratório de Anatomia Patológica do Príncipe Real Alfred e Hospitais Repatriação Concord para a recolha de amostras frescas de CRC e na mucosa intestinal normal. O trabalho foi financiado por um New South Wales Instituto do Câncer Grant Programa translacional.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
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