מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion
Summary
מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר את<em> In vivo</em> המצב מאשר דו מימדי מבחני תנועתיות. באמצעות פלישה מטריצה מבחני בשילוב עם הדמיה confocal של תאים fluorescently שכותרתו, מידע מפורט על דרכי הפלישה התרומות נפרדות של מוביל לעומת התאים הבאים ניתן להשיג.
Abstract
המאפיין המגדיר של ממאירות סרטן הפלישה גרורות 1. בכמה סוגי סרטן (ה g. Glioma 2), פלישה מקומית לתוך הרקמה הבריאה המקיפה אותה היא שורש של מחלות ומוות. עבור סוגי סרטן אחרים (ה g. השד, סרטן ריאות, וכו '.), הוא תהליך של גרורות, שבו תאים סרטניים לנוע ממקום הגידול הראשוני מסה, ליישב אתרי דיסטלי, ובסופו של דבר לתרום כשל איברים, שבסופו של דבר מוביל לתחלואה תמותה 3. ההערכה היא כי הפלישה גרורות אחראים ל -90% ממקרי המוות מסרטן 4. כתוצאה מכך, חלה עניין רב בזיהוי תהליכים מולקולריים המתווכים חלבון קריטית של הפלישה גרורות לצורך אבחון וטיפול בשיפור 5.
האתגר העומד בפני החוקרים הוא לפתח סרטן מבחני הפלישה כי די דומה למצב in vivoכדי לאפשר דוגמנות מחלה מדויק 6. דו מימדי תנועתיות מבחני סלולריים הם רק אינפורמטיבי על היבט אחד של הפלישה אינם מביאים בחשבון שיפוץ תאי חלבון מטריקס (ECM) אשר גם הוא אלמנט קריטי. לאחרונה, מחקרים מעודן ההבנה שלנו של הפלישה תא הגידול גילה כי תאים בודדים יכול לנוע על ידי מצבי מוארך או מעוגל 7. בנוסף, חלה הערכה גדולה יותר של התרומה של הפלישה קיבוצי, שבו תאים לפלוש בקווצות, סדינים אשכולות, בעיקר גידולים מובחנים מאוד כי לשמור על המאפיינים אפיתל, להתפשטות סרטן 8.
אנו מציגים שיטה מעודן 9 לבחינת תרומתם של חלבונים מועמד לפלישה קולקטיבית 10. בפרט, על ידי הנדסה בריכות נפרדות של תאים לבטא את חלבוני ניאון שונים, אפשר מולקולרי לנתח את הפעילויות proteins הנדרשים בתאים המובילים לעומת אלו הנדרשים בתאים הבאים. השימוש RNAi מספק את הכלי מולקולרית בניסוי לפרק את התהליכים הכרוכים הפלישה תא יחיד, כמו גם עמדות שונות של חדירה קולקטיבית. בהליך זה, תערובות של תאים fluorescently שכותרתו הם מצופה בתחתית להוסיף Transwell מילא בעבר עם חלבון ECM Matrigel, אז מותר לפלוש "כלפי מעלה" דרך המסנן לתוך Matrigel. שחזור של סדרת Z-ערימות התמונה, מתקבל על ידי הדמיה confocal, תוך ייצוג תלת מימדי המאפשר הדמיה של קולקטיבי גדילי הפולש וניתוח של ייצוג של תאים fluorescently שכותרתו מובילים לעומת העמדות הבאות.
Protocol
Discussion
מבחני Matrigel הפלישה מסורתי הוקמו עם תאים להציב על גבי שכבה של חלבון תאי מטריקס עם תנועתיות chemoattractant-Induced לכיוון ועל דרך פילטר בתחתית. הפולשנות היה הבקיע כפונקציה של כמה תאים אפשר לסמוך על החלק התחתון של המסנן. אמנם למעשה יש הבדל קטן עם assay "הפוך" הפלישה שתוארו לעיל, ק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון למחקר זה הוא מן לחקר הסרטן בבריטניה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
