Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva
Summary
Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir a<em> In vivo</em> Situação do que os ensaios bidimensionais motilidade. Usando ensaios matriz invasão combinada com imagem confocal de células fluorescente-etiquetados, informações detalhadas sobre os modos de invasão e as contribuições distintas de líder contra seguintes células podem ser obtidas.
Abstract
A característica definidora de malignidade do câncer é a invasão e metástase 1. Em alguns tipos de câncer (e. g. Glioma 2), a invasão local para o tecido saudável é a principal causa de doença e morte. Para outros tipos de câncer (e. g. Pulmão, mama, etc.), É o processo de metástase, em que as células tumorais se mover de uma massa do tumor primário, colonizar locais distal e, finalmente, contribuir para a falência de órgãos, que eventualmente leva à morbidade e mortalidade 3. Estima-se que a invasão e metástases são responsáveis por 90% das mortes por câncer 4. Como resultado, tem havido grande interesse em identificar os processos moleculares e mediadores de proteína crítica de invasão e metástase para fins de diagnóstico e tratamento melhorando a 5.
Um desafio para os cientistas é o desenvolvimento de câncer de ensaios de invasão que se assemelham bastante a situação in vivo empara permitir a modelagem exata da doença 6. Bidimensional ensaios motilidade celular são apenas informativos sobre um aspecto da invasão e não levam em conta remodelação proteína de matriz extracelular (ECM), que também é um elemento crítico. Recentemente, pesquisas têm refinado a nossa compreensão de invasão das células tumorais e revelou que células individuais pode mover-se por modos alongadas ou arredondadas 7. Além disso, tem havido maior valorização da contribuição de invasão coletiva, na qual as células invadem em fios, chapas e aglomerados, principalmente em tumores altamente diferenciados que mantêm características epiteliais, para a propagação do câncer 8.
Nós apresentamos um método refinado 9 para examinar as contribuições de proteínas candidatas à invasão coletiva 10. Em particular, piscinas de engenharia separadas de células para expressar diferentes proteínas fluorescentes, é possível dissecar molecularmente as atividades e Proteins necessária em células líder versus aqueles exigidos nas células seguintes. O uso de RNAi fornece a ferramenta molecular para desmontar experimentalmente os processos envolvidos na invasão de células individuais, bem como em diferentes posições de invasão coletiva. Neste procedimento, as misturas de células fluorescente-etiquetados são banhados no fundo de uma inserção de Transwell previamente preenchido com Matrigel proteína ECM, então permissão para invadir "para cima" através do filtro e no Matrigel. Reconstrução de pilhas z-series imagem, obtida por imagem confocal, em representações tridimensionais permite a visualização de fios coletivamente invadindo e análise da representação das células fluorescente-etiquetadas na liderança contra seguintes posições.
Protocol
Discussion
Ensaios de invasão Matrigel têm sido tradicionalmente criado com células colocado sobre uma camada de proteínas da matriz extracelular com chemoattractant induzida motilidade para e através de um filtro na parte inferior. Invasão foi classificada como uma função de quantas células podem ser contadas na parte inferior do filtro. Embora praticamente há pouca diferença com o ensaio de invasão "inversa" descrita acima, há consideravelmente mais informações sobre o processo de invasão que pode ser d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento para esta pesquisa é do Cancer Research UK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
References
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