Modélisation et Imagerie en 3 dimensions l'invasion des cellules collectives

Summary

Modèles de l'invasion des cellules tumorales en trois dimensions de la matrice extracellulaire de mieux refléter la<em> In vivo</em> La situation de tests de motilité en deux dimensions. En utilisant des tests d'invasion matrice combinée avec l'imagerie confocale de cellules marqué par fluorescence, des informations détaillées sur les modes d'invasion et les contributions distinctes de leader par rapport suivants cellules peuvent être obtenues.

Abstract

Une caractéristique de la malignité du cancer est ^une invasion et la métastase. Dans certains cancers (e. g. Gliome ^2), invasion locale dans les tissus environnants sains est à l'origine de la maladie et la mort. Pour d'autres cancers (e. g. Sein, poumon, etc.), C'est le processus de métastase, dans lequel les cellules tumorales de passer d'une masse tumorale primaire, colonisent les sites distale et finalement contribuer à une défaillance organique, qui mène éventuellement à la morbidité et la de mortalité ^3. Il a été estimé que l'invasion et les métastases sont responsables de 90% des décès par cancer ^4. En conséquence, il a été un vif intérêt dans l'identification des processus moléculaires et les médiateurs protéiques critique de l'invasion et les métastases à des fins d'améliorer le diagnostic et le traitement ^5.

Un défi pour les scientifiques est de développer un cancer des dosages invasion qui ressemble plus suffisamment à la situation in vivopour permettre la modélisation des maladies précises ^6. Deux dimensions tests de motilité des cellules sont seulement informatifs sur un aspect de l'invasion et ne prennent pas en compte remodelage matriciel protéine extracellulaire (ECM) qui est aussi un élément critique. Récemment, la recherche a affiné notre compréhension de l'invasion des cellules tumorales et des cellules individuelles a révélé que peuvent se déplacer par des modes allongés ou arrondis ^7. En outre, il a été plus grande appréciation de la contribution de l'invasion collective, dans laquelle les cellules envahir en brins, les feuilles et les grappes, en particulier dans les tumeurs hautement différenciées qui maintiennent des caractéristiques épithéliales, à la propagation du cancer ^8.

Nous présentons une méthode raffinée ⁹ pour examiner les contributions des protéines candidates à l'invasion collective ^10. En particulier, par des pools d'ingénierie séparées des cellules d'exprimer différentes protéines fluorescentes, il est possible de disséquer moléculairement les activités et Proteins nécessaires dans les cellules de leader par rapport à ceux requis dans les cellules suivantes. L'utilisation de l'ARNi constitue l'outil moléculaire pour démonter expérimentalement les processus impliqués dans l'invasion des cellules individuelles ainsi que dans différentes positions d'invasion collective. Dans cette procédure, des mélanges de cellules marqué par fluorescence sont plaquées sur le fond d'un insert Transwell préalablement rempli par Matrigel ECM protéines, a ensuite permis d'envahir "par le haut» à travers le filtre et dans le Matrigel. Reconstruction des piles d'images de la série Z, obtenue par imagerie confocale, en trois dimensions des représentations permet de visualiser collectivement brins d'invasion et d'analyse de la représentation de cellules marqué par fluorescence dans les principaux postes suivants par rapport.

Protocol

1. Étiquetage rétrovirale de cellules avec des protéines fluorescentes Cellules de la plaque d'encapsidation rétrovirale (ex Phoenix) à à 0,25 x 10 6 cellules par puits d'une 6-même plat dans 10% sérum de veau fœtal (FBS) / DMEM. Cellules avec un ADN rétroviral Transfecter 48 heures plus tard les cellules en utilisant Effectene conformément aux instructions du fabricant. Rincer les puits deux fois avec support 24 heures plus tard, p…

Discussion

Dosages invasion de Matrigel ont traditionnellement été mis en place avec des cellules placées sur une couche de protéine de la matrice extracellulaire avec chimiotactique induite par la motilité vers et à travers un filtre à la base. Envahissement a été marqué en fonction du nombre de cellules peut être compté sur la partie inférieure du filtre. Bien que pratiquement il ya peu de différence avec le dosage de l'invasion "inverse" décrit ci-dessus, il ya beaucoup plus d'informations sur l…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	GIBCO	21969
Fetal Bovine Serum	PAA	A15-101
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140
200 mM L-Glutamine (100x)	GIBCO	25050-032
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668019
6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Confocal microcope	Leica	SP2MP