Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

Summary

Los modelos de la invasión de células tumorales en tres dimensiones de la matriz extracelular para reflejar mejor la<em> En vivo</em> Situación de los ensayos de la motilidad de dos dimensiones. Utilizando los ensayos de invasión de la matriz combinada con la imagen confocal de las células con fluorescencia etiquetado, información detallada sobre los modos de invasión y las diferentes contribuciones de los líderes frente a las siguientes células se pueden obtener.

Abstract

Una característica definitoria de la malignidad del cáncer es ^una invasión y metástasis. En algunos tipos de cáncer (e. g. Glioma ^2), invasión local en el tejido sano circundante es la causa de la enfermedad y la muerte. Para otros tipos de cáncer (e. g. De mama, pulmón, etc.), Es el proceso de metástasis, en el que las células tumorales pasan de una masa tumoral primaria, colonizar los sitios distales y en última instancia, contribuir a la insuficiencia de órganos, que finalmente conduce a la morbilidad y la mortalidad a los ^3. Se ha estimado que la invasión y las metástasis son responsables del 90% de las muertes por cáncer ^4. Como resultado, ha habido un gran interés en la identificación de los procesos moleculares y mediadores críticos de proteínas de invasión y metástasis a los efectos de mejorar el diagnóstico y tratamiento ^5.

Un reto para los científicos es desarrollar cáncer de ensayos de invasión que se asemejan bastante a la situación in vivo enpara permitir el modelado preciso enfermedad ^6. Dos dimensiones ensayos motilidad celular son sólo informativos acerca de un aspecto de la invasión y no tienen en cuenta la remodelación de proteínas de matriz extracelular (ECM), que es también un elemento crítico. Recientemente, la investigación ha mejorado nuestra comprensión de la invasión de células tumorales, y reveló que las células individuales pueden moverse por los modos de forma alargada o redondeada ^7. Además, ha habido un mayor reconocimiento de la contribución de la invasión colectiva, en la que las células invaden en filamentos, hojas y racimos, sobre todo en tumores altamente diferenciadas que mantienen las características del epitelio, a la propagación del cáncer ^8.

Se presenta un método refinado ⁹ para examinar los aportes de proteínas candidatas a la invasión de colectivos ^10. En particular, por las piscinas de ingeniería independiente de las células para expresar diferentes proteínas fluorescentes, es posible analizar molecularmente las actividades y proteinurians requerido en las células principales en comparación con los requeridos en las celdas siguientes. El uso de ARNi proporciona la herramienta molecular para desmontar experimentalmente los procesos involucrados en la invasión de células individuales, así como en diferentes posiciones de la invasión colectiva. En este procedimiento, las mezclas de las células con fluorescencia etiquetados se colocan en la parte inferior de un inserto de Transwell Matrigel previamente llena de proteínas ECM, luego se deja invadir "hacia arriba" a través del filtro y en el Matrigel. La reconstrucción de las pilas de la imagen de la serie Z, que se obtiene por la imagen confocal, en representaciones tridimensionales permite la visualización de forma colectiva hilos invadir y análisis de la representación de las células con fluorescencia marcado en la dirección frente a las siguientes posiciones.

Protocol

1. Etiquetado retroviral de células con proteínas fluorescentes Células de la placa de embalaje retrovirales (por ejemplo, Phoenix) de un total de 0,25 x 10 6 células por pocillo de una 6-y plato fetal al 10% de suero bovino (FBS) / DMEM. Transfectar las células con el ADN retroviral 48 horas después, las células con Effectene de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enjuague pocillos dos veces con medio de 24 horas después, a continuaci…

Discussion

Los ensayos de invasión Matrigel tradicionalmente han sido establecidos con células colocadas sobre una capa de proteína de matriz extracelular con quimiotáctica inducida por la movilidad hacia ya través de un filtro en la parte inferior. La invasión se calificó como una función de cuántas células se podía contar en la parte inferior del filtro. Aunque en la práctica hay poca diferencia con el ensayo "inversa" invasión se ha descrito anteriormente, hay mucha más información sobre el proceso de i…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	GIBCO	21969
Fetal Bovine Serum	PAA	A15-101
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140
200 mM L-Glutamine (100x)	GIBCO	25050-032
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668019
6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Confocal microcope	Leica	SP2MP