Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Summary

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij de<em> In vivo</em> Situatie dan twee-dimensionale beweeglijkheid testen. Met behulp van matrix invasie assays in combinatie met confocale beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen, gedetailleerde informatie over de invasie modi en de verschillende bijdragen van toonaangevende versus volgende cellen kunnen worden verkregen.

Abstract

Een kenmerkende eigenschap van kanker maligniteit is invasie en metastase ^1. In sommige kankers (e. g. Glioma ^2), locale invasie in het omringende gezonde weefsel is de oorzaak van ziekte en dood. Voor andere vormen van kanker (e. g. Borstkanker, longkanker, enz..), Het is het proces van metastase, waarbij tumorcellen zich van een primaire tumor massa, koloniseren distale sites en uiteindelijk bij te dragen tot orgaanfalen, dat leidt uiteindelijk tot morbiditeit en sterfte ^3. Er wordt geschat dat de invasie en metastasen zijn verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen door kanker ^4. Als gevolg hiervan, is er intense belangstelling voor het identificeren van de moleculaire processen en kritische eiwit bemiddelaars van invasie en metastasering ten behoeve van verbetering van de diagnose en de behandeling ^5.

Een uitdaging voor kanker wetenschappers is het ontwikkelen van invasie assays die voldoende lijken op de in vivo situatieom nauwkeurige ziekte modelleren ⁶ mogelijk te maken. Twee-dimensionale celbeweeglijkheid tests zijn louter informatief over een aspect van invasie en geen rekening houden met de extracellulaire matrix (ECM) eiwit remodeling, die ook is een cruciaal element. Onlangs heeft onderzoek verfijnd ons begrip van tumorcel invasie en toonde aan dat individuele cellen kunnen verplaatsen door lange of bolvormige modes ^7. Daarnaast is er een grotere waardering van de bijdrage van collectieve invasie, waarbij de cellen binnen te dringen in strengen, lakens en clusters, met name in zeer gedifferentieerde tumoren die te behouden epitheliale kenmerken, om de verspreiding van kanker ^8.

We presenteren een verfijnde methode ⁹ voor de behandeling van de bijdragen van kandidaat-eiwitten op collectieve invasie ^10. In het bijzonder, door engineering aparte zwembaden van cellen om verschillende fluorescerende eiwitten te drukken, is het mogelijk om moleculair ontleden de activiteiten en proteins nodig in het leiden van cellen ten opzichte van die welke vereist zijn in de volgende cellen. Het gebruik van RNAi biedt de moleculaire tool om experimenteel te demonteren de processen die betrokken zijn bij individuele cel invasie alsook in verschillende posities van de collectieve invasie. In deze procedure, mengsels van fluorescent gelabelde cellen worden uitgeplaat op de bodem van een Transwell insert eerder gevuld met Matrigel ECM-eiwit, daarna liet men het "omhoog" binnen te dringen door het filter en in de Matrigel. Reconstructie van z-series image stacks, verkregen door confocale beeldvorming, in drie-dimensionale representaties zorgt voor visualisatie van collectief invasie strengen en de analyse van de representatie van de fluorescent gelabelde cellen in toonaangevende versus volgende posities.

Protocol

1. Retrovirale labeling van cellen met fluorescente eiwitten Plaat retrovirale verpakking cellen (bv. Phoenix) uit op 0,25 x 10 6 cellen per putje van een 6-well schotel in 10% foetaal bovine serum (FBS) / DMEM. Transfecteren cellen met retrovirale DNA 48 uur later cellen met behulp van Effectene volgens de instructies van de fabrikant. Spoel twee keer putten later met medium 24 uur, voeg vervolgens 1,5 ml van 10% FBS / DMEM per well. Verzam…

Discussion

Matrigel invasie assays zijn van oudsher opgezet met cellen geplaatst op een laag van extracellulaire matrix eiwit met chemoattractant geïnduceerde beweeglijkheid naar en door een filter aan de onderkant. Invasiviteit werd gescoord als een functie van het aantal cellen kunnen worden geteld aan de onderkant van het filter. Hoewel praktisch is er weinig verschil met de "inverse" invasie assay hierboven beschreven, is er aanzienlijk meer informatie over het proces van invasie die kan worden bepaald door het visu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	GIBCO	21969
Fetal Bovine Serum	PAA	A15-101
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140
200 mM L-Glutamine (100x)	GIBCO	25050-032
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668019
6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Confocal microcope	Leica	SP2MP